s**********a
发帖数: 92 | 1 目的：已知蛋白A结合一个promoter，下步想鉴定其他跟A同时结合此promoter的蛋白。
请问大家做过此类实验么？有什么现成的kit可买么？
谢谢！ |
x********e
发帖数: 35261 | 2 没做过，从理论上说说我的思路。
ChIP拿到的是所有可能结合蛋白A的DNA。coIP拿到的是所有可能结合蛋白A的蛋白。你要
限制在特定promoter的话要用DNA pull down protein去打质谱，然后用coIP去证实pro
tein complex里的成员。
【在 s**********a 的大作中提到】
: 目的：已知蛋白A结合一个promoter，下步想鉴定其他跟A同时结合此promoter的蛋白。
: 请问大家做过此类实验么？有什么现成的kit可买么？
: 谢谢！
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K**R
发帖数: 193 | 3 我记得有个PICH文章，你看看吧 发到cell了
Proteomics of Isolated Chromatin Segments
Kingston Lab, 2012 |
s**********a
发帖数: 92 | 4 谢谢楼上两位！
本来以为早就有成熟的方法呢。
平时做CHIP的时候其中有一步是把蛋白和DNA分开，难道此时收集分开的蛋白不可行么
？比如也用proteinA/G来富集。
谢谢！ |
s**********a
发帖数: 92 | 5 这个DNA pull down protein怎么实现？in vitro么？谢谢！
你要
pro
【在 x********e 的大作中提到】
: 没做过，从理论上说说我的思路。
: ChIP拿到的是所有可能结合蛋白A的DNA。coIP拿到的是所有可能结合蛋白A的蛋白。你要
: 限制在特定promoter的话要用DNA pull down protein去打质谱，然后用coIP去证实pro
: tein complex里的成员。
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f**u
发帖数: 346 | 6 这个以前版上讨论过，其实想过这么做的人不少。
以现在的质谱技术，需要大概0.1pmole的蛋白质才能比较准确的鉴定，你可以去算算你
需要多少细胞，然后你就明白那个pich的文章为什么选择端粒了。 |
K******S
发帖数: 10109 | 7 这需要什么成熟的方法呢？只要你能把蛋白和DNA分开就可以了，
：谢谢楼上两位！
：本来以为早就有成熟的方法呢。 |
K******S
发帖数: 10109 | 8 0.1 pmole太保守了，10年前在thermo最老的质谱上我们的QC是5 fmole.
：这个以前版上讨论过，其实想过这么做的人不少。
： |
s**********a
发帖数: 92 | 9 我们做CHIP 用的是 milippore kit.
按照他们的protocol是这样分离蛋白和DNA的：
E. Reverse Crosslinks of Protein/DNA Complexes to Free DNA
1. To all tubes (IPs and Inputs) add 8μl 5M NaCl and incubate at 65°C for
4-5 hours or overnight to reverse the DNA – Protein crosslinks. After this
step the sample can be stored at -20°C and the protocol continued the next
day.
2. To all tubes, add 1μl of RNase A and incubate for 30 minutes at 37°C.
3. Add 4μl 0.5M EDTA, 8μl 1M Tris-HCl and 1μl Proteinase K and incubate
at 45°C for 1-2 hours.
请问做完 step1 后，此时分离出来的蛋白是什么情况？各蛋白此时是否还连在一起？
做chip时的抗体还跟抗原结合着么？
如果各蛋白，还有抗体还都在一起的话，此时可以用protein AG 富集。如果各自都分
开了，就不好办了。
【在 K******S 的大作中提到】
: 这需要什么成熟的方法呢？只要你能把蛋白和DNA分开就可以了，
:
: ：谢谢楼上两位！
: ：本来以为早就有成熟的方法呢。
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K******S
发帖数: 10109 | 10 无论结合着还是一锅粥一样对做后面质谱没有太大的区别
：我们做CHIP 用的是 milippore kit.
：按照他们的protocol是这样分离蛋白和DNA的： |
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x********e
发帖数: 35261 | 11 https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/protein-biology/
protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-
protein-methods/methods-detecting-protein-dna-interactions.html
【在 s**********a 的大作中提到】
: 这个DNA pull down protein怎么实现？in vitro么？谢谢！
:
: 你要
: pro
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x********e
发帖数: 35261 | 12 可以。但富集的蛋白不一定跟A一起结合在promoter上，这跟coIP打质谱有什么区别呢？
【在 s**********a 的大作中提到】
: 谢谢楼上两位！
: 本来以为早就有成熟的方法呢。
: 平时做CHIP的时候其中有一步是把蛋白和DNA分开，难道此时收集分开的蛋白不可行么
: ？比如也用proteinA/G来富集。
: 谢谢！
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K******S
发帖数: 10109 | 13 IP-protein-protein和IP-protein-DNA-protein可能会不一样吧
：可以。但富集的蛋白不一定跟A一起结合在promoter上，这跟coIP打质谱有什么区别
呢？
： |
x********e
发帖数: 35261 | 14 有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的target
。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋白/
DNA之间有无关联。
【在 K******S 的大作中提到】
: IP-protein-protein和IP-protein-DNA-protein可能会不一样吧
:
: ：可以。但富集的蛋白不一定跟A一起结合在promoter上，这跟coIP打质谱有什么区别
: 呢？
: ：
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K******S
发帖数: 10109 | 15 当然的有control啊，或者pre-clear,或者搞个competition什么的
：有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的
target
：。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋
白/DNA之间有无关联。 |
k*****n
发帖数: 323 | 16 蛋白的量都不是问题，只要scale够。不好搞的是交联后的蛋白就是mess，不好打质谱
。如果预期可能有几个什么蛋白，拉下来做wb到可以。 |
x********e
发帖数: 35261 | 17 你如何control？
【在 K******S 的大作中提到】
: 当然的有control啊，或者pre-clear,或者搞个competition什么的
:
: ：有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的
: target
: ：。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋
: 白/DNA之间有无关联。
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K******S
发帖数: 10109 | 18 CHIP第一步不的crosslink蛋白和DNA吗，当然和提总蛋白后做co-ip不一样
：你如何control？
： |
x********e
发帖数: 35261 | 19 我的意思是你无法通过control知道IP下来的某些蛋白跟某一promoter有没有联系。
【在 K******S 的大作中提到】
: CHIP第一步不的crosslink蛋白和DNA吗，当然和提总蛋白后做co-ip不一样
:
: ：你如何control？
: ：
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f**u
发帖数: 346 | 20 我知道有人用更少的蛋白，不过好像结果都不是特别理想。
你可以把样品直接扔到质谱里面，那样一般得到几百个hit，后期工作量太大。
这种一般都是质谱技术方面的文章，我还没看到作功能的文章用这么少量的蛋白做鉴定。
我看到的成功的例子，基本都是跑个SDS-PAGE染出条带了，然后切下来作质谱。
比如上面提到的pich，还有那个乙肝病毒受体的文章。
以前版上讨论的时候有做质谱的专家说过，质谱的背景大概就在fmole级别。
你说的这个5fmole我不知道具体是怎么回事，我猜是非常理想条件下才做得出吧，
比如理想的溶液体系，单一蛋白，而且纯度还很高？
【在 K******S 的大作中提到】
: 0.1 pmole太保守了，10年前在thermo最老的质谱上我们的QC是5 fmole.
:
: ：这个以前版上讨论过，其实想过这么做的人不少。
: ：
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f**u
发帖数: 346 | 21 看你ID应该是质谱方面的专业人士，
能不能介绍一下蛋白质谱技术的现状，
我也希望能用更少的蛋白做出鉴定。
【在 K******S 的大作中提到】
: 0.1 pmole太保守了，10年前在thermo最老的质谱上我们的QC是5 fmole.
:
: ：这个以前版上讨论过，其实想过这么做的人不少。
: ：
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f**u
发帖数: 346 | 22 还是有区别的。
楼主的目的是拿到promoter上结合的其他蛋白，这些蛋白跟他的蛋白A未必直接结合，
如果没有DNA在，这样的蛋白就会丢掉。
另外，有时候两个蛋白只有结合在DNA上的时候才有相互作用。
target
白/
【在 x********e 的大作中提到】
: 有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的target
: 。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋白/
: DNA之间有无关联。
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K******S
发帖数: 10109 | 23 ：（
我取这个名字的时候还不知道质谱是什么东西呢，巧合而已
dynamic range， 蛋白的氨基酸序列和离子化的效率是proteomics里永恒的主题，
不过一般来说MALDI需要50-100 fmole左右，LCMSMS 5-10 fmole左右应该可以比较精确
的签订蛋白了，而且现在的仪器都是high resolution的，蛋白鉴定不需要很多的肽段
，有几个高质量的就可以了
我们和生物实验室合作最大的问题是其实生物实验室里由于做和抗体有关的试验，比如
WB比较多，所以平时不太注意样品的洁净度，90%的时候样品里都有很多的角蛋白污染
。很不幸的是质谱非常灵敏而角蛋白离子化很好
【在 f**u 的大作中提到】
: 看你ID应该是质谱方面的专业人士，
: 能不能介绍一下蛋白质谱技术的现状，
: 我也希望能用更少的蛋白做出鉴定。
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K******S
发帖数: 10109 | 24 做蛋白功能的试验比简单的未知蛋白鉴定要的样品量高很多。是因为简单的鉴定几个肽
段就够了，深入研究一个蛋白就的要尽可能多的序列覆盖，尤其各种PTM一般
stoichiometry很低
定。
【在 f**u 的大作中提到】
: 我知道有人用更少的蛋白，不过好像结果都不是特别理想。
: 你可以把样品直接扔到质谱里面，那样一般得到几百个hit，后期工作量太大。
: 这种一般都是质谱技术方面的文章，我还没看到作功能的文章用这么少量的蛋白做鉴定。
: 我看到的成功的例子，基本都是跑个SDS-PAGE染出条带了，然后切下来作质谱。
: 比如上面提到的pich，还有那个乙肝病毒受体的文章。
: 以前版上讨论的时候有做质谱的专家说过，质谱的背景大概就在fmole级别。
: 你说的这个5fmole我不知道具体是怎么回事，我猜是非常理想条件下才做得出吧，
: 比如理想的溶液体系，单一蛋白，而且纯度还很高？
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x********e
发帖数: 35261 | 25 所以我说必须用promoter序列做DNA pull down。你就算ChIP用DNA稳定蛋白间的相互作
用，也无法证明complex是结合在该promoter上。
【在 f**u 的大作中提到】
: 还是有区别的。
: 楼主的目的是拿到promoter上结合的其他蛋白，这些蛋白跟他的蛋白A未必直接结合，
: 如果没有DNA在，这样的蛋白就会丢掉。
: 另外，有时候两个蛋白只有结合在DNA上的时候才有相互作用。
:
: target
: 白/
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f**u
发帖数: 346 | 26 样品不纯这个问题在我这个生物出身的人看来太正常了。
因为IP一类的技术本身就很脏，能拉下来太多乱七八糟东西了，这个没办法。
无论你使用DNA，蛋白还是小分子作probe，
都会拉下几百上千个蛋白，大部分都是非特异的。
我见过几篇做得漂亮的功能类文章，
一般是已知一个东西在某个信号或者生物现象里面很重要，
然后用它作为probe去做IP，在IP下来的东西里面用质谱鉴定发现一个蛋白，
然后用一系列功能试验证明这个新蛋白也在同一个信号或生物现象里有重要作用。
这样的研究几乎无一例外都是IP玩了以后跑SDS-PAGE然后切胶用MALDI，
我猜可能的原因是这样做一般只拿到20个左右的主要hit，
后期功能验证就可行了。
我只在一个大会上听说过有一个人用了LCMSMS，
虽然样品量小了很多，但是拿到两百个以上的hit，
这里面大部分都是垃圾，所以功能验证很是问题。
我猜这个可能是为什么寻找新功能性蛋白的人还是喜欢MALDI，
虽然拿到那么多样品有时候很头疼。
【在 K******S 的大作中提到】
: ：（
: 我取这个名字的时候还不知道质谱是什么东西呢，巧合而已
: dynamic range， 蛋白的氨基酸序列和离子化的效率是proteomics里永恒的主题，
: 不过一般来说MALDI需要50-100 fmole左右，LCMSMS 5-10 fmole左右应该可以比较精确
: 的签订蛋白了，而且现在的仪器都是high resolution的，蛋白鉴定不需要很多的肽段
: ，有几个高质量的就可以了
: 我们和生物实验室合作最大的问题是其实生物实验室里由于做和抗体有关的试验，比如
: WB比较多，所以平时不太注意样品的洁净度，90%的时候样品里都有很多的角蛋白污染
: 。很不幸的是质谱非常灵敏而角蛋白离子化很好
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r***z
发帖数: 19 | |
s**********a
发帖数: 92 | 28 这个是我要考虑的问题！你说的很对，我没法保证A只结合这一个promoter。理论上A也
不可能只结合这一个promoter。看来还得再好好想想！
target
白/
【在 x********e 的大作中提到】
: 有什么不同？你是coIP，不管拉下来的是蛋白还是DNA，都含有特异和非特异的target
: 。除非已知A只特异结合在该promoter处，你无法通过coIP本身知道共沉淀下来的蛋白/
: DNA之间有无关联。
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s**********a
发帖数: 92 | 29 谢谢！这个看着不错。我再仔细看看。
【在 r***z 的大作中提到】
: 这个基于CRISPR的enCHIP技术可以实现你的想法
: https://www.addgene.org/crispr/fujii/
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