g*********3
发帖数: 177 | 1 各位有沒有點子或者設想？
目前的方法有DNA affinity purification ，標題的那篇文章是09年的,PICH,但是聽說
還沒有實驗室能重複LNA-based PICH.
大家隨便說說。（不知道輸入法怎麼變成了繁體～） |
y*********u
发帖数: 183 | 2 CHIP-Re CHIP;
Crosslinking and subsequent Western/Southern, and LC-MS downstream of it;
CO-IP using locus knock out cell line as control;
etc |
s******s
发帖数: 13035 | 3 看不懂。连什么protein都不知道，怎么western?
【在 y*********u 的大作中提到】
: CHIP-Re CHIP;
: Crosslinking and subsequent Western/Southern, and LC-MS downstream of it;
: CO-IP using locus knock out cell line as control;
: etc
|
s******s
发帖数: 13035 | 4 头疼啊。我有一个project也在试类似的东西，做不出啊
【在 g*********3 的大作中提到】
: 各位有沒有點子或者設想？
: 目前的方法有DNA affinity purification ，標題的那篇文章是09年的,PICH,但是聽說
: 還沒有實驗室能重複LNA-based PICH.
: 大家隨便說說。（不知道輸入法怎麼變成了繁體～）
|
g*********5
发帖数: 2533 | 5 可以合成这段DNA,生物素标记，然后裂解细胞核，mix overnight
然后 Streptavidin Magnetic Beads
这样标记的DNA被拉下来。复合体也被拉下来
设计好对照。 |
n********k
发帖数: 2818 | 6 I believe many have been thinking or trying along the line, me as an example
for at least over 6 years I actually came to this lab thinking I could have
the freedom to pursue this as my boss had the similar idea during my
interview...however aftertalking to some experts in the field, I don't
Think it is that easy although i'll for sure make a major effort on this
once I have a job...
X
【在 g*********3 的大作中提到】
: 各位有沒有點子或者設想？
: 目前的方法有DNA affinity purification ，標題的那篇文章是09年的,PICH,但是聽說
: 還沒有實驗室能重複LNA-based PICH.
: 大家隨便說說。（不知道輸入法怎麼變成了繁體～）
|
s******s
发帖数: 13035 | 7 你这个想的太简单了，最多pull下来一些直接bind的transcription factor。
你这段DNA至少要足够大，带所有上下游信息，然后整合，然后ips，然后做成
老鼠，然后找到你要的细胞，然后pull下来的才是真的
【在 g*********5 的大作中提到】
: 可以合成这段DNA,生物素标记，然后裂解细胞核，mix overnight
: 然后 Streptavidin Magnetic Beads
: 这样标记的DNA被拉下来。复合体也被拉下来
: 设计好对照。
|
s******s
发帖数: 13035 | 8 其实这个实验的关键不是动手的部分，关键是ms-spec分辨率不够。
如果ms-spec能够发展个5年10年，我看就很好做了
example
have
【在 n********k 的大作中提到】
: I believe many have been thinking or trying along the line, me as an example
: for at least over 6 years I actually came to this lab thinking I could have
: the freedom to pursue this as my boss had the similar idea during my
: interview...however aftertalking to some experts in the field, I don't
: Think it is that easy although i'll for sure make a major effort on this
: once I have a job...
:
: X
|
l****y
发帖数: 398 | 9 sorry to be negative.
But it seems anything based on affinity purification-MS won't work.
As far as i know, people have tried all sorts of tricks (crosslinking,
minichromatin,targeted cleavage, silac)and failed.
The nonspecific background is ridiculous. It is like every protein is there.
Of course, sometimes a lucky person can pick out one interesting protein by
sharp instinct. but in general, it fails.
if you can make it work as well as CHIP,you get a career.
【在 g*********3 的大作中提到】
: 各位有沒有點子或者設想？
: 目前的方法有DNA affinity purification ，標題的那篇文章是09年的,PICH,但是聽說
: 還沒有實驗室能重複LNA-based PICH.
: 大家隨便說說。（不知道輸入法怎麼變成了繁體～）
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n********k
发帖数: 2818 | 10 That's what I heard too...The sensitivity or the noise versa background
problem...However, I am still wondering whether there would be any way to
alleviate the problem to the extent that it could provide some meaningful
clues...Or maybe have to go with some kind of microfluid CHIP in conjunction
with MS...I am just thinking aloud...lots of idea on the upstream but no
idea about the real experience or downstream indentification part....It
would be such a tech advance in the entire TF/Epigenetic field if this can
be solved...
【在 s******s 的大作中提到】
: 其实这个实验的关键不是动手的部分，关键是ms-spec分辨率不够。
: 如果ms-spec能够发展个5年10年，我看就很好做了
:
: example
: have
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n********k
发帖数: 2818 | 11 Sounds some insider on this...Thanks for the comments...Could you please
elaborate a bit more, what about those very abound TF and known to bind an
element? I am talking about taking a know TF to verify the tech...what's
sensitivity or noise V signal in such scenario...
there.
by
【在 l****y 的大作中提到】
: sorry to be negative.
: But it seems anything based on affinity purification-MS won't work.
: As far as i know, people have tried all sorts of tricks (crosslinking,
: minichromatin,targeted cleavage, silac)and failed.
: The nonspecific background is ridiculous. It is like every protein is there.
: Of course, sometimes a lucky person can pick out one interesting protein by
: sharp instinct. but in general, it fails.
: if you can make it work as well as CHIP,you get a career.
|
n********k
发帖数: 2818 | 12 based on a friend who is a biochemist and an epigenetic expert...The
telomere locus is very much different from other scenario and likely a much
easier target but it still took long time for this paper to get through the
reviewing...
【在 g*********3 的大作中提到】
: 各位有沒有點子或者設想？
: 目前的方法有DNA affinity purification ，標題的那篇文章是09年的,PICH,但是聽說
: 還沒有實驗室能重複LNA-based PICH.
: 大家隨便說說。（不知道輸入法怎麼變成了繁體～）
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f**u
发帖数: 346 | 13 我觉得这个话题挺有意思的。
难道有很多人试过干这个事情了吗？还是有人试过很多次了？
如果那样的话我挺佩服的，做这个事情需要的细胞数量非常非常大吧。
这个做那么一次的需要多少投入多少时间呀，
如果有人能做三次真得很让人佩服。
there.
by
【在 l****y 的大作中提到】
: sorry to be negative.
: But it seems anything based on affinity purification-MS won't work.
: As far as i know, people have tried all sorts of tricks (crosslinking,
: minichromatin,targeted cleavage, silac)and failed.
: The nonspecific background is ridiculous. It is like every protein is there.
: Of course, sometimes a lucky person can pick out one interesting protein by
: sharp instinct. but in general, it fails.
: if you can make it work as well as CHIP,you get a career.
|
f**u
发帖数: 346 | 14 要做到和ChIP一样容易好像很难，关键是蛋白质没法扩增。
一般MS的最低要求是0.1 picomole的蛋白，如果你用细胞就需要10^11以上，
也就是几百升的数量级，这个是没法减少的。
当然如果你有办法用动物，一只老鼠应该足够了。
conjunction
【在 n********k 的大作中提到】
: That's what I heard too...The sensitivity or the noise versa background
: problem...However, I am still wondering whether there would be any way to
: alleviate the problem to the extent that it could provide some meaningful
: clues...Or maybe have to go with some kind of microfluid CHIP in conjunction
: with MS...I am just thinking aloud...lots of idea on the upstream but no
: idea about the real experience or downstream indentification part....It
: would be such a tech advance in the entire TF/Epigenetic field if this can
: be solved...
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n********k
发帖数: 2818 | 15 Thanks I c now...I am very ignorant about the MS part...That's a huge amount
of
cells---to be a bit more accurate:)) it is about 6X10^10...that's about 6000
plates of 10M cells per plates...Provided one could get absolute no-
background...u think we are doomed on this, at least for now?...I am not
gonna giving up
thinking along this, maybe I am being stupid now:)))
【在 f**u 的大作中提到】
: 要做到和ChIP一样容易好像很难，关键是蛋白质没法扩增。
: 一般MS的最低要求是0.1 picomole的蛋白，如果你用细胞就需要10^11以上，
: 也就是几百升的数量级，这个是没法减少的。
: 当然如果你有办法用动物，一只老鼠应该足够了。
:
: conjunction
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y******8
发帖数: 1764 | 16 Design a genetic screening first, then CHIP validation.
Why choose the difficult path?
amount
6000
【在 n********k 的大作中提到】
: Thanks I c now...I am very ignorant about the MS part...That's a huge amount
: of
: cells---to be a bit more accurate:)) it is about 6X10^10...that's about 6000
: plates of 10M cells per plates...Provided one could get absolute no-
: background...u think we are doomed on this, at least for now?...I am not
: gonna giving up
: thinking along this, maybe I am being stupid now:)))
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f**u
发帖数: 346 | 17 呵呵，你是在假设纯化的产率是100%。
我也没很仔细地想过这个技术只不过这个技术的原理并不复杂，
ChIP出来了那么多年肯定有人想过也做过，
但是目前还没成气候，所以肯定是有一些技术问题在里面的。
当然有技术问题也就说明有机会，并不一定是坏事情。
另外，需要细胞多这个很烦，但是对于去除背景来说也许是好事情。
刚才去看了看楼主提到的文章，他们用telomere的主要原因就是因为拷贝数大，
一个细胞有100个左右，这样细胞用量可以减少两个数量级。
amount
6000
【在 n********k 的大作中提到】
: Thanks I c now...I am very ignorant about the MS part...That's a huge amount
: of
: cells---to be a bit more accurate:)) it is about 6X10^10...that's about 6000
: plates of 10M cells per plates...Provided one could get absolute no-
: background...u think we are doomed on this, at least for now?...I am not
: gonna giving up
: thinking along this, maybe I am being stupid now:)))
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n********k
发帖数: 2818 | 18 Yes, that's why they worked on telomere...For MS, what's the bottle neck in
term of the sensitivity...how come it needs 10^11 molecules?? I just
searched on line and tried to figure that one out myself...it seems for some
serum protein, it could detect 1pg/ml or even lower...depending on the
loading volume, that could be a lot lower than 0.1pM right?....
【在 f**u 的大作中提到】
: 呵呵，你是在假设纯化的产率是100%。
: 我也没很仔细地想过这个技术只不过这个技术的原理并不复杂，
: ChIP出来了那么多年肯定有人想过也做过，
: 但是目前还没成气候，所以肯定是有一些技术问题在里面的。
: 当然有技术问题也就说明有机会，并不一定是坏事情。
: 另外，需要细胞多这个很烦，但是对于去除背景来说也许是好事情。
: 刚才去看了看楼主提到的文章，他们用telomere的主要原因就是因为拷贝数大，
: 一个细胞有100个左右，这样细胞用量可以减少两个数量级。
:
: amount
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n********k
发帖数: 2818 | 19 Absolutely agree, but it would be a much more direct and economical way(
potentially more powerfully too) if it didn't techniqually seem impossible
as of now...
【在 y******8 的大作中提到】
: Design a genetic screening first, then CHIP validation.
: Why choose the difficult path?
:
: amount
: 6000
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g*********3
发帖数: 177 | 20 感谢各位大神的帮助。
我倒是觉得MS resolution的问题不是很大，neverthink想的那个点子其实正是我们在
做的，microfluid技术说不定可以部分解决binding的问题。 我个人觉得最大的问题是
如何design DNA oligonucleotide的问题。 It depends on how to define enhancer.
..
当然了，这些都是in vitro的。如果能in vivo就好了。 |
|
|
g*********3
发帖数: 177 | 21 谢谢！
确实这个问题挺困难，目前还没有什么号的方法。我很头疼，难道我只能靠猜测几个
potential TFs, 然后做ChIP-seq了 （对于我的project）？这样发现某些新东西的可
能性就不大了。各位说的都很有道理：
Shakuras说的DNA长度的问题，目前很多人做的（Bulyk @ Harvard）都只是10-mer,至
于想模拟chromatin之类那么长的DNA我觉得很难。
难道是个悲剧。。。。这个project挺有意思的，以前发过贴问过版上各位可惜没人回
复。
即将拿到ChIP-seq的数据，但是不知道下一步怎么走。如各位说的：
怎样Purify specific的TFs complex，太难了。
conjunction
【在 n********k 的大作中提到】
: That's what I heard too...The sensitivity or the noise versa background
: problem...However, I am still wondering whether there would be any way to
: alleviate the problem to the extent that it could provide some meaningful
: clues...Or maybe have to go with some kind of microfluid CHIP in conjunction
: with MS...I am just thinking aloud...lots of idea on the upstream but no
: idea about the real experience or downstream indentification part....It
: would be such a tech advance in the entire TF/Epigenetic field if this can
: be solved...
|
g*********3
发帖数: 177 | 22 谢谢。我还没做过这个实验。
是nonspecific太多呢，还是基本purify nothing呢？我怎么感觉到in vitro affinity
purification因为不是Physiology condition，可能啥都钓不到。当然，如果有什么
东西，很有可能是nonspecific了。
顺带问下：如果把这个作为phd project来做。。。是不是SB了。
there.
by
【在 l****y 的大作中提到】
: sorry to be negative.
: But it seems anything based on affinity purification-MS won't work.
: As far as i know, people have tried all sorts of tricks (crosslinking,
: minichromatin,targeted cleavage, silac)and failed.
: The nonspecific background is ridiculous. It is like every protein is there.
: Of course, sometimes a lucky person can pick out one interesting protein by
: sharp instinct. but in general, it fails.
: if you can make it work as well as CHIP,you get a career.
|
f**u
发帖数: 346 | 23 你是从哪个网页上看到这个灵敏度的？
我记得前一阵子听报告人家做protein MS的说要0.1 pmole，
我刚才差了一下网上也差不多。
in
some
【在 n********k 的大作中提到】
: Yes, that's why they worked on telomere...For MS, what's the bottle neck in
: term of the sensitivity...how come it needs 10^11 molecules?? I just
: searched on line and tried to figure that one out myself...it seems for some
: serum protein, it could detect 1pg/ml or even lower...depending on the
: loading volume, that could be a lot lower than 0.1pM right?....
|
f**u
发帖数: 346 | 24 看了半天原来是要坐in vitro，这样就容易很多了。
我记得二十几年前就有人用nuclear extract来泡合成的oligo，
然后用gel shift作为readout来纯化DNA binding protein了。
困难的是in vivo。
enhancer.
【在 g*********3 的大作中提到】
: 感谢各位大神的帮助。
: 我倒是觉得MS resolution的问题不是很大，neverthink想的那个点子其实正是我们在
: 做的，microfluid技术说不定可以部分解决binding的问题。 我个人觉得最大的问题是
: 如何design DNA oligonucleotide的问题。 It depends on how to define enhancer.
: ..
: 当然了，这些都是in vitro的。如果能in vivo就好了。
|
f**u
发帖数: 346 | 25 也不用那么麻烦吧，还iPS什么的，直接作个转基因老鼠就可以了。
其实这些上游准备都不算什么，关键是纯化的protocol。
【在 s******s 的大作中提到】
: 其实这个实验的关键不是动手的部分，关键是ms-spec分辨率不够。
: 如果ms-spec能够发展个5年10年，我看就很好做了
:
: example
: have
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l****y
发帖数: 398 | 26 In an orbitrap, 100fmol peptide usually give a normalized counts of 10^7 -
10^8. The noise is around 10^4 -10^5.
【在 f**u 的大作中提到】
: 你是从哪个网页上看到这个灵敏度的？
: 我记得前一阵子听报告人家做protein MS的说要0.1 pmole，
: 我刚才差了一下网上也差不多。
:
: in
: some
|
s******s
发帖数: 13035 | 27 well, 因为最近研究epigenetics，所以思路里面最好的control
就是分化细胞和ips过再重新分化的细胞
【在 f**u 的大作中提到】
: 也不用那么麻烦吧，还iPS什么的，直接作个转基因老鼠就可以了。
: 其实这些上游准备都不算什么，关键是纯化的protocol。
|
s******s
发帖数: 13035 | 28 大家参考一下。其实我是没有精力做的，有人成功的话给我acknowledge就够了。
找你要研究的基因的BAC，然后再E.Coli里面通过homologous recombination在
有兴趣的片段（当然要比较长的）两头加rare的RE site或者ZFN一类的，随便折
腾；里面再加点strong的aptamer, 或者变态点，加一堆lacO.
这玩意儿做成转基因IPS或者ES，好处是可以多copy, 十个八个没问题吧，更多
应该也行吧? 然后做成转基因小鼠，取你有兴趣的特定组织，或者细胞培养，
做ChIP的前面部分就是fix，洗掉细胞质，然后instead of sonication, 用RE
一顿乱切，配合aptamer purification. 你可以先size select然后affinity,
或者先affinity然后size select, 或者几种不同的方法series affinity，
anyway, 拿到东西decrosslinking上ms spec, 当然前面crosslink的时候不能
用glycine quench.
这个思路欢迎大家补充。
【在 g*********3 的大作中提到】
: 谢谢！
: 确实这个问题挺困难，目前还没有什么号的方法。我很头疼，难道我只能靠猜测几个
: potential TFs, 然后做ChIP-seq了 （对于我的project）？这样发现某些新东西的可
: 能性就不大了。各位说的都很有道理：
: Shakuras说的DNA长度的问题，目前很多人做的（Bulyk @ Harvard）都只是10-mer,至
: 于想模拟chromatin之类那么长的DNA我觉得很难。
: 难道是个悲剧。。。。这个project挺有意思的，以前发过贴问过版上各位可惜没人回
: 复。
: 即将拿到ChIP-seq的数据，但是不知道下一步怎么走。如各位说的：
: 怎样Purify specific的TFs complex，太难了。
|
f**u
发帖数: 346 | 29 握手。我下午也想了想，怎么能够不用DNA杂交来分离目标片断。
基本思路和你想得类似，但是还没你想得那么细。
然后刚刚上网艘文献，发现有人用了跟你说得几乎一样的方法在E.coli里做过了。
DNA sampling: a method for probing protein binding at specific loci
on bacterial chromosomes
看来这个idea还是有不少人想到过的。
做细菌好呀，一升细菌足够用了，如果是小鼠组织的话可能要公斤级。
另外就是我更加确定了肯定有人做过或者正在做类似的事情，但是有技术问题。
【在 s******s 的大作中提到】
: 大家参考一下。其实我是没有精力做的，有人成功的话给我acknowledge就够了。
: 找你要研究的基因的BAC，然后再E.Coli里面通过homologous recombination在
: 有兴趣的片段（当然要比较长的）两头加rare的RE site或者ZFN一类的，随便折
: 腾；里面再加点strong的aptamer, 或者变态点，加一堆lacO.
: 这玩意儿做成转基因IPS或者ES，好处是可以多copy, 十个八个没问题吧，更多
: 应该也行吧? 然后做成转基因小鼠，取你有兴趣的特定组织，或者细胞培养，
: 做ChIP的前面部分就是fix，洗掉细胞质，然后instead of sonication, 用RE
: 一顿乱切，配合aptamer purification. 你可以先size select然后affinity,
: 或者先affinity然后size select, 或者几种不同的方法series affinity，
: anyway, 拿到东西decrosslinking上ms spec, 当然前面crosslink的时候不能
|
n********k
发帖数: 2818 | 30 tons of people thinking along this way---me and my boss included...Last year
when I finally had some time to fool around:)) and talked to my friend and
asked for his Gal4 etc constructs and he recommended me to use Lac. But he
also essentially point it out that as of now it is extremely hard if not
possible and tons of people are thinking about this problem...
【在 f**u 的大作中提到】
: 握手。我下午也想了想，怎么能够不用DNA杂交来分离目标片断。
: 基本思路和你想得类似，但是还没你想得那么细。
: 然后刚刚上网艘文献，发现有人用了跟你说得几乎一样的方法在E.coli里做过了。
: DNA sampling: a method for probing protein binding at specific loci
: on bacterial chromosomes
: 看来这个idea还是有不少人想到过的。
: 做细菌好呀，一升细菌足够用了，如果是小鼠组织的话可能要公斤级。
: 另外就是我更加确定了肯定有人做过或者正在做类似的事情，但是有技术问题。
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s******s
发帖数: 13035 | 31 这个思路我想过几次了。思路不难，技术上也不难，难的是一个
人要所有的技术都会，还要一直optimize, 说到底生物还是实验科学，
idea不值钱啊
【在 f**u 的大作中提到】
: 握手。我下午也想了想，怎么能够不用DNA杂交来分离目标片断。
: 基本思路和你想得类似，但是还没你想得那么细。
: 然后刚刚上网艘文献，发现有人用了跟你说得几乎一样的方法在E.coli里做过了。
: DNA sampling: a method for probing protein binding at specific loci
: on bacterial chromosomes
: 看来这个idea还是有不少人想到过的。
: 做细菌好呀，一升细菌足够用了，如果是小鼠组织的话可能要公斤级。
: 另外就是我更加确定了肯定有人做过或者正在做类似的事情，但是有技术问题。
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s******s
发帖数: 13035 | 32 小鼠有些组织细胞很小很多的，比如thymus。 不过这玩意儿貌似细胞分开了
还会重新黏在一起，不知道这么多thymus chip怎么做的，我试了一下不太方便
【在 f**u 的大作中提到】
: 握手。我下午也想了想，怎么能够不用DNA杂交来分离目标片断。
: 基本思路和你想得类似，但是还没你想得那么细。
: 然后刚刚上网艘文献，发现有人用了跟你说得几乎一样的方法在E.coli里做过了。
: DNA sampling: a method for probing protein binding at specific loci
: on bacterial chromosomes
: 看来这个idea还是有不少人想到过的。
: 做细菌好呀，一升细菌足够用了，如果是小鼠组织的话可能要公斤级。
: 另外就是我更加确定了肯定有人做过或者正在做类似的事情，但是有技术问题。
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s******s
发帖数: 13035 | 33 //nod. 那个PICH的paper我bet至少有100个实验室试过，竟然能让
那个家伙做出来，很佩服
year
and
【在 n********k 的大作中提到】
: tons of people thinking along this way---me and my boss included...Last year
: when I finally had some time to fool around:)) and talked to my friend and
: asked for his Gal4 etc constructs and he recommended me to use Lac. But he
: also essentially point it out that as of now it is extremely hard if not
: possible and tons of people are thinking about this problem...
|
n********k
发帖数: 2818 | 34 So that would mean the sensitivity/resolution could go lower than 0.1pM,
right, maybe 10-100 fold? That would be doable for some cell culture or
tissue work. BTW, I am an MS-idiot:)))...
【在 l****y 的大作中提到】
: In an orbitrap, 100fmol peptide usually give a normalized counts of 10^7 -
: 10^8. The noise is around 10^4 -10^5.
|
n********k
发帖数: 2818 | 35 negative selection, tons of DNA? so very sticky, treat with DNase? just my
pure imagination...
【在 s******s 的大作中提到】
: //nod. 那个PICH的paper我bet至少有100个实验室试过，竟然能让
: 那个家伙做出来，很佩服
:
: year
: and
|
s******s
发帖数: 13035 | 36 说实话，那个PICH我还没有全部理解。
理论上，sonicate以后，不被protein protect的DNA应该断掉了，
但是杂交的时候，被protein crosslink的部分应该不容易杂上吧？
是不是和前面有人说的telomere的所谓特殊结构有关系?
year
and
【在 n********k 的大作中提到】
: tons of people thinking along this way---me and my boss included...Last year
: when I finally had some time to fool around:)) and talked to my friend and
: asked for his Gal4 etc constructs and he recommended me to use Lac. But he
: also essentially point it out that as of now it is extremely hard if not
: possible and tons of people are thinking about this problem...
|
n********k
发帖数: 2818 | 37 So, what's the bottle-neck for MS sensitivity/resolution?
【在 s******s 的大作中提到】
: //nod. 那个PICH的paper我bet至少有100个实验室试过，竟然能让
: 那个家伙做出来，很佩服
:
: year
: and
|
s******s
发帖数: 13035 | 38 guess 定量复杂，不能扩增？
【在 n********k 的大作中提到】
: So, what's the bottle-neck for MS sensitivity/resolution?
|
f**u
发帖数: 346 | 39 这个和sonication的具体条件有关吧。
DNA的断点和蛋白结合点之间可能会有几百个bp，足够杂交了。
另外如果探针序列在两个蛋白结合位点之间也有可能杂上，
假设DNA在这两个蛋白结合位点之间没有被打断的话。
【在 s******s 的大作中提到】
: 说实话，那个PICH我还没有全部理解。
: 理论上，sonicate以后，不被protein protect的DNA应该断掉了，
: 但是杂交的时候，被protein crosslink的部分应该不容易杂上吧？
: 是不是和前面有人说的telomere的所谓特殊结构有关系?
:
: year
: and
|
n********k
发帖数: 2818 | 40 but 0.1pM is still a lot---that's 10^11....I believe the DNA Sequencer could
do way better than that....I just don't understand what's the problems? Any
other sensitive approaches than MS available to identify an unknown
molecules?
【在 s******s 的大作中提到】
: guess 定量复杂，不能扩增？
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n********k
发帖数: 2818 | 41 Sounds reasonable to me...Biology is about trying to see whether it will
work...sometimes it just doesn't work the way we can reason...
【在 f**u 的大作中提到】
: 这个和sonication的具体条件有关吧。
: DNA的断点和蛋白结合点之间可能会有几百个bp，足够杂交了。
: 另外如果探针序列在两个蛋白结合位点之间也有可能杂上，
: 假设DNA在这两个蛋白结合位点之间没有被打断的话。
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s******s
发帖数: 13035 | 42 所以我觉得有运气的因素。
做ChIP类得，sonicate成monomer, 基本上两头有个一二十bp的free dna
顶多了吧，不太会有几百。感觉上可能是因为telomere那里可能是一堆
蛋白+DNA团在一起，sonicate不开。如果是这样的话，这个PiCH可能不容
易在其他普通的chromatin上做
【在 f**u 的大作中提到】
: 这个和sonication的具体条件有关吧。
: DNA的断点和蛋白结合点之间可能会有几百个bp，足够杂交了。
: 另外如果探针序列在两个蛋白结合位点之间也有可能杂上，
: 假设DNA在这两个蛋白结合位点之间没有被打断的话。
|
f**u
发帖数: 346 | 43 其实DNA sequencing和protein mass spec对于样品数量在一个数量级上。
一个bp的分子量大概是675，0.1pmole的1kb PCR product大概是70ng，
基本就是你送测序的量了。
could
Any
【在 n********k 的大作中提到】
: but 0.1pM is still a lot---that's 10^11....I believe the DNA Sequencer could
: do way better than that....I just don't understand what's the problems? Any
: other sensitive approaches than MS available to identify an unknown
: molecules?
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m******5
发帖数: 1383 | 44 我觉得你和我回帖的思路差不多…… RE 切fix过的，southern + western，都是size
sepcific的
前面有人说还不知道是什么蛋白怎么办，其实我觉得关键是有一个idea这个序列是
activate的还是repressive 的 可以用一些已知的co-activator或者co-repressor来
locate. 要是序列的功能都不知道就难办了……
【在 s******s 的大作中提到】
: 大家参考一下。其实我是没有精力做的，有人成功的话给我acknowledge就够了。
: 找你要研究的基因的BAC，然后再E.Coli里面通过homologous recombination在
: 有兴趣的片段（当然要比较长的）两头加rare的RE site或者ZFN一类的，随便折
: 腾；里面再加点strong的aptamer, 或者变态点，加一堆lacO.
: 这玩意儿做成转基因IPS或者ES，好处是可以多copy, 十个八个没问题吧，更多
: 应该也行吧? 然后做成转基因小鼠，取你有兴趣的特定组织，或者细胞培养，
: 做ChIP的前面部分就是fix，洗掉细胞质，然后instead of sonication, 用RE
: 一顿乱切，配合aptamer purification. 你可以先size select然后affinity,
: 或者先affinity然后size select, 或者几种不同的方法series affinity，
: anyway, 拿到东西decrosslinking上ms spec, 当然前面crosslink的时候不能
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f**u
发帖数: 346 | 45 我倒不这么看。
ChIP是故意把sonication的条件调到那样的，
binding site两边有那么一点点DNA可以确定在genome里的位置就可以了，
因为你希望最后结果是一个很尖的峰，如果DNA留得太长峰会变得不那么sharp。
这个并不是说sonication就一定会把DNA打得在binding site两边只剩那么短。
他们在做Pich的时候肯定把sonication的能量减小了，
打完的DNA平均长度肯定要大很多。
【在 s******s 的大作中提到】
: 所以我觉得有运气的因素。
: 做ChIP类得，sonicate成monomer, 基本上两头有个一二十bp的free dna
: 顶多了吧，不太会有几百。感觉上可能是因为telomere那里可能是一堆
: 蛋白+DNA团在一起，sonicate不开。如果是这样的话，这个PiCH可能不容
: 易在其他普通的chromatin上做
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s******s
发帖数: 13035 | 46 //nod.
刚查了一下PiCH的protocol, ms确实不强，大概2-4kb,那么中间就应该有很多bind
ing site了
【在 f**u 的大作中提到】
: 我倒不这么看。
: ChIP是故意把sonication的条件调到那样的，
: binding site两边有那么一点点DNA可以确定在genome里的位置就可以了，
: 因为你希望最后结果是一个很尖的峰，如果DNA留得太长峰会变得不那么sharp。
: 这个并不是说sonication就一定会把DNA打得在binding site两边只剩那么短。
: 他们在做Pich的时候肯定把sonication的能量减小了，
: 打完的DNA平均长度肯定要大很多。
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n********k
发帖数: 2818 | 47 you are referring to the traditional sequencing reaction...what about the
high throughput sequencing reaction(I am actually ignorant about here too:))
)...Also, I thought the RNA-Seq(the real one:))) doesn't need any
amplification of RNAs...so that would be a lot less than 0.1pM...
【在 f**u 的大作中提到】
: 其实DNA sequencing和protein mass spec对于样品数量在一个数量级上。
: 一个bp的分子量大概是675，0.1pmole的1kb PCR product大概是70ng，
: 基本就是你送测序的量了。
:
: could
: Any
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s******s
发帖数: 13035 | 48 you are wrong.
RNA seq need amplification after addition of adaptors
))
【在 n********k 的大作中提到】
: you are referring to the traditional sequencing reaction...what about the
: high throughput sequencing reaction(I am actually ignorant about here too:))
: )...Also, I thought the RNA-Seq(the real one:))) doesn't need any
: amplification of RNAs...so that would be a lot less than 0.1pM...
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n********k
发帖数: 2818 | 49 In a sense, you don't want the power too strong and the fragment too short
here...otherwise kind of lose the goal of developing the protocol... After
all I don't we aim to use this method to determine exact location of the
binding sites...
【在 s******s 的大作中提到】
: //nod.
: 刚查了一下PiCH的protocol, ms确实不强，大概2-4kb,那么中间就应该有很多bind
: ing site了
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n********k
发帖数: 2818 | 50 rather different...if you have an idea of what are possible candidates,
there are easier ways to sort it out...
size
【在 m******5 的大作中提到】
: 我觉得你和我回帖的思路差不多…… RE 切fix过的，southern + western，都是size
: sepcific的
: 前面有人说还不知道是什么蛋白怎么办，其实我觉得关键是有一个idea这个序列是
: activate的还是repressive 的 可以用一些已知的co-activator或者co-repressor来
: locate. 要是序列的功能都不知道就难办了……
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l****y
发帖数: 398 | 51 that's correct.
【在 n********k 的大作中提到】
: So that would mean the sensitivity/resolution could go lower than 0.1pM,
: right, maybe 10-100 fold? That would be doable for some cell culture or
: tissue work. BTW, I am an MS-idiot:)))...
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s******s
发帖数: 13035 | 52 恩。知道binding protein再回头找binding site就容易多了
【在 n********k 的大作中提到】
: In a sense, you don't want the power too strong and the fragment too short
: here...otherwise kind of lose the goal of developing the protocol... After
: all I don't we aim to use this method to determine exact location of the
: binding sites...
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n********k
发帖数: 2818 | 53 I am talking about the Single-Molecule RNA seq, directly use the RNA rather
than the RNA-seq(actually should be called cDNA-Seq) everyone is talking
about
【在 s******s 的大作中提到】
: you are wrong.
: RNA seq need amplification after addition of adaptors
:
: ))
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s******s
发帖数: 13035 | 54 don't Know that. do u mean pacbio? is their direct rna-seq commercialized?
rather
【在 n********k 的大作中提到】
: I am talking about the Single-Molecule RNA seq, directly use the RNA rather
: than the RNA-seq(actually should be called cDNA-Seq) everyone is talking
: about
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n********k
发帖数: 2818 | 55 Then it came back to my initial question again, what's the real problem here
making it so hard...because we only have 2 copies of the binding even per
cells and that could be easily buried in background...or else??
If the sensitive is around 0.1pM, I wouldn't even think to try with any stem
cell work or mammalian cells....if it could go down by a factor of 50-100
or so, then it might be worth trying...even 10 is still not enough, still
take too many plates (600 plates of stem cells is like a joke:))), at least
for me now...
【在 l****y 的大作中提到】
: that's correct.
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s******s
发帖数: 13035 | 56 看你有没有钱，你的project有没有意义了。
有高级的ms spec，可以sample量少100倍。不过你有劝那种实验室
帮你做ms spec的精力还不如养1000盘ESC
here
stem
least
【在 n********k 的大作中提到】
: Then it came back to my initial question again, what's the real problem here
: making it so hard...because we only have 2 copies of the binding even per
: cells and that could be easily buried in background...or else??
: If the sensitive is around 0.1pM, I wouldn't even think to try with any stem
: cell work or mammalian cells....if it could go down by a factor of 50-100
: or so, then it might be worth trying...even 10 is still not enough, still
: take too many plates (600 plates of stem cells is like a joke:))), at least
: for me now...
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n********k
发帖数: 2818 | 57 I c...don't know, likely not yet...but I am talking about the potentials...
this is really an issue close to many hardcore TF/epigenetic people's heart.
.. not quite like the way many go like the Harvard lady you mentioned:)))...
.it is kind of like teaser--they just mess around it but never get to the
real sweet stuff...
【在 s******s 的大作中提到】
: don't Know that. do u mean pacbio? is their direct rna-seq commercialized?
:
: rather
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s******s
发帖数: 13035 | 58 最终理想，那个IBM还是GE的啥测序孔一类的，DNA拉一遍就知道序列了。
进化版本，chromosome拉一边，把所有epigenetic marker全读一遍。
heart.
..
【在 n********k 的大作中提到】
: I c...don't know, likely not yet...but I am talking about the potentials...
: this is really an issue close to many hardcore TF/epigenetic people's heart.
: .. not quite like the way many go like the Harvard lady you mentioned:)))...
: .it is kind of like teaser--they just mess around it but never get to the
: real sweet stuff...
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n********k
发帖数: 2818 | 59 can u name some labs or type of MS which could do this? sounds very rare
ones??
【在 s******s 的大作中提到】
: 看你有没有钱，你的project有没有意义了。
: 有高级的ms spec，可以sample量少100倍。不过你有劝那种实验室
: 帮你做ms spec的精力还不如养1000盘ESC
:
: here
: stem
: least
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n********k
发帖数: 2818 | 60 Sure..:) but I am not counting on them on the epigenetic marker stuff....
【在 s******s 的大作中提到】
: 最终理想，那个IBM还是GE的啥测序孔一类的，DNA拉一遍就知道序列了。
: 进化版本，chromosome拉一边，把所有epigenetic marker全读一遍。
:
: heart.
: ..
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s******s
发帖数: 13035 | 61 没用心记。忘记是公司广告上的还是paper上的。很可能是paper上
看到的，哪个national lab专做ms的paper, 所以应该比较rare
【在 n********k 的大作中提到】
: can u name some labs or type of MS which could do this? sounds very rare
: ones??
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n********k
发帖数: 2818 | 62 it seems the tech is around the corner now(or maybe not:)), I just searched
online and it seems some are talking about single molecule MS now....
【在 s******s 的大作中提到】
: 没用心记。忘记是公司广告上的还是paper上的。很可能是paper上
: 看到的，哪个national lab专做ms的paper, 所以应该比较rare
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g****1
发帖数: 261 | 63
This is still a tough problem. I am aware that a few friends have been
trying the modified method reviewed here with modest success. You might get
some ideas there.
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cb100294v
【在 g*********3 的大作中提到】
: 各位有沒有點子或者設想？
: 目前的方法有DNA affinity purification ，標題的那篇文章是09年的,PICH,但是聽說
: 還沒有實驗室能重複LNA-based PICH.
: 大家隨便說說。（不知道輸入法怎麼變成了繁體～）
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i*****g
发帖数: 11893 | 64 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
不好做，估计是个死途。
这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
编剧。但其实，那个Locus上面可能有几十种特殊蛋白在调控！！！
2004年底，我的想法来源于推广TAP+MS，我已知 TAP+MS 去做蛋白，那么我如何寻求
DNA protein complex?
办法大致是在某段DNA序列两边加上multiple copies operators，在这两串operators
外侧加上一串restriction enzyme sites repeats， 这样纯化时，酶切后，也来两次
TAP，捞到你要的东西。这个思路本贴有人提及了。
但事情没有这么简单，后来知道越来越多，下面说说技术限制。
1. obitrap MS+ mudpit 大致可以鉴定1ng protein，低于此就不佳。
因为MS不是说捞出你的peptide就完事的。ms背景很高，你需要足够数量的蛋白
产生spectra counts 来显突在你的背景之上，我个人建议 >50个spectra counts来证
明你的信号。虽然John yates 实验室的人回答我的询问，ms的极限是fentomol when
in liquid。但这个是理想，而且是溶解很好的液体样品。
这个就是目前ms的极限了。我当然知道大家的希望：你们ms的人如果提高灵敏100倍，
我们可以少养几百盘细胞了。但，很遗憾，ms就这样了。
2，选binding protein-operator时，最好找非常强的Protein，建议用phage lambda里
面的cro lexA lambdaI之类的，我恐怕GAL4之类的不够强悍。一般而言，这种binding
Kd可以达到 nM级别，而且phage 文献古老，甚至可以用一些超阻遏突变(extra tight
binding)。但问题又来了，你准备体外制备affinity beads呢，还是干脆体内表达？
你确信RE酶切足够温和？
3， 你要是准备做这种cell line,基于homologous recombination考虑，只能用小鼠
ESC系列了。stable cell line leads you random insert Susceptible to allien
chromatin locus which may fool you into wrong conclusion。
4，记住你最多有 2 DNA loci，你需要1ng protein 进入ms， 考虑纯化的损失，这个
大幅度升高了你要的细胞数量。 你简单增加到100 liters，如果TAP特异不够，也是白
搭： Signal/N 并没有有利变化，只是总量增加了而已。
5. 和大家说一下ms背景，一般做soluble protein complex时，大家不是看见几篇典型
CNS论文，SDS-PAGE silver staining时，对照空白无带，your sample get smear of
protein bands？ 其实，我最初也有这个刻板印象，但后来我做了很多蛋白和ms样品，
可以说，CNS上面那些，是很少见的例子，属于特别的领域，比如RNA splicing。多数
时候，你根本达不到那个程度。
6. 一般TAP会给出300-500个蛋白，然后你在里面捞出你要的5-10个感兴趣的蛋白。反
复几百次ms，可以熟悉一些老是出现在ms里面的粘性蛋白：这些都是noise，junk。但
这个loci TAP不同，我个人预期，noise是惊人的，包括大家一般无兴趣的histone（最
好用dynaBeads-Ab预先清理掉这些junk）
7. 最好不用crosslink，背景太多无法忍受。sonication要非常弱小，要小心。
你考虑完这些事情，你还有兴致做这个？
于是你会选择简化版本：
1. 你用很大的BAC，模拟chromatin，转染，然后收获BAC，一个细胞几百几千copy，搞
个几十盘细胞。
这个仍然很麻烦，于是你再次简化，
合成oligo, wild type Vs mutant，挂上dynabeads，
然后去买Hela nuclear extract，incubate, wash, elute, MS
于是你的构思就缩水成 比基尼，你的起始梦想全成了泡影， 于是你就再次验证了生物
wsn的科研生命。：）） |
g*********3
发帖数: 177 | 65 原来这么多人关心这个问题 呵呵。
其实某位说的ZNF的想法,我读了一篇paper,已经有类似的人做了,但是发的paper貌似很
一般.
至于MS的问题，昨天和老板讨论了下，fisher orbitrap 貌似能检测到<0.1pmol吧。
其实把多个copy转到chromosome里面去是个好方法，但是这个在动物身上就不好做了吧。
听完各位描述，顿时觉得phd得延期是必然吧。。。（或者毕业no publication） |
g*********3
发帖数: 177 | 66 这个有人做了。。。效果不是很好貌似。（转的质粒）
关键是你还得保证用于纯化目的的那段序列不会起到recruit TFs and GTFs...造成假
阳性
【在 i*****g 的大作中提到】
: 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
: 这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
: 后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
: 和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
: 他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
: point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
: 来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
: 不好做，估计是个死途。
: 这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
: 法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
|
g*********3
发帖数: 177 | 67 谢谢。看到ACS比较激动，隐约感觉到这个问题得biophysics的东西帮助解决。
get
【在 g****1 的大作中提到】
:
: This is still a tough problem. I am aware that a few friends have been
: trying the modified method reviewed here with modest success. You might get
: some ideas there.
: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cb100294v
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g*********3
发帖数: 177 | 68 请问single molecule MS...能给个链接吗？
searched
【在 n********k 的大作中提到】
: it seems the tech is around the corner now(or maybe not:)), I just searched
: online and it seems some are talking about single molecule MS now....
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g*********5
发帖数: 2533 | 69 I am not professional...
【在 s******s 的大作中提到】
: 没用心记。忘记是公司广告上的还是paper上的。很可能是paper上
: 看到的，哪个national lab专做ms的paper, 所以应该比较rare
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n********k
发帖数: 2818 | 70 Good one...Kind of what I have been going through although I am still not
giving up hoping something might happen with MS...anybody working with
microfluid stuff or if those thing could in any way help the sensitivity or
detection limit problem...any expert there?
【在 i*****g 的大作中提到】
: 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
: 这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
: 后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
: 和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
: 他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
: point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
: 来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
: 不好做，估计是个死途。
: 这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
: 法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
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n********k
发帖数: 2818 | 71 googled last night...
【在 g*********3 的大作中提到】
: 请问single molecule MS...能给个链接吗？
:
: searched
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n********k
发帖数: 2818 | 72 BTW, the two PIs you worked are so weak...or they are not in the related
field?...to any reasonable one(even a good junior grad) in TF/epigenetics,
it is simply so obvious...
【在 i*****g 的大作中提到】
: 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
: 这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
: 后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
: 和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
: 他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
: point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
: 来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
: 不好做，估计是个死途。
: 这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
: 法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
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f**u
发帖数: 346 | 73 谢谢信息。具体作过的和我们几个纸上谈兵的就是不一样。
【在 i*****g 的大作中提到】
: 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
: 这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
: 后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
: 和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
: 他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
: point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
: 来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
: 不好做，估计是个死途。
: 这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
: 法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
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i*****g
发帖数: 11893 | 74 我觉得，玩技术突破不是不可以做，
比如那个哈佛的yang shi，做histone demethylation的，就是靠TAP+ms，弄到一个新
蛋白
但是，我认为主流是玩story，making sexy story是主流,
functional study & disease
弄这些技术，突破，是次流，很容易辛苦很久，也没有什么特别的功能
这个没有办法，就类似：你认为美国股市应该崩溃，但大佬们不认为
人在江湖，生存第一 |
i***l
发帖数: 1656 | 75 true
spt
【在 i*****g 的大作中提到】
: 我觉得，玩技术突破不是不可以做，
: 比如那个哈佛的yang shi，做histone demethylation的，就是靠TAP+ms，弄到一个新
: 蛋白
: 但是，我认为主流是玩story，making sexy story是主流,
: functional study & disease
: 弄这些技术，突破，是次流，很容易辛苦很久，也没有什么特别的功能
: 这个没有办法，就类似：你认为美国股市应该崩溃，但大佬们不认为
: 人在江湖，生存第一
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