y*****a
发帖数: 6 | 1 之前博后用超声仪ChIP结果好好滴。。。。
后来隔壁平台买了个diagenode的bioruptor，老板非让我用bioruptor做超声。结果一
样的引物ChIP-qPCR没显著性差异。
想了想，感觉是在超声之后，离心一把，发现lysate里有些白色漂浮的不溶絮状物，离
心也沉不到管底。
记得原来冻过的蛋白有时候化了会析出来这样的絮状物，怀疑是不是超声太猛把蛋白给
析出来了。
超声条件是30s on，30s off，总共30个cycle。。。
求大神给指点指点。。。。 |
D***a
发帖数: 516 | 2 bioruptor很好用。30cycle太多了，我一般就用6个。
【在 y*****a 的大作中提到】
: 之前博后用超声仪ChIP结果好好滴。。。。
: 后来隔壁平台买了个diagenode的bioruptor，老板非让我用bioruptor做超声。结果一
: 样的引物ChIP-qPCR没显著性差异。
: 想了想，感觉是在超声之后，离心一把，发现lysate里有些白色漂浮的不溶絮状物，离
: 心也沉不到管底。
: 记得原来冻过的蛋白有时候化了会析出来这样的絮状物，怀疑是不是超声太猛把蛋白给
: 析出来了。
: 超声条件是30s on，30s off，总共30个cycle。。。
: 求大神给指点指点。。。。
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k*******n
发帖数: 963 | 3 同意楼上分析，DNA打成太小BP的碎片就不能再拉PCR了。你在超声破碎之后上清液处理
一下直接用引物拉一次PCR看看，顺便摸摸条件，免得浪费抗体。
[在 yinyeya (yinyeya) 的大作中提到：]
：
：之前博后用超声仪ChIP结果好好滴。。。。
：........... |
g********6
发帖数: 86 | 4 可能是SDS
【在 y*****a 的大作中提到】
: 之前博后用超声仪ChIP结果好好滴。。。。
: 后来隔壁平台买了个diagenode的bioruptor，老板非让我用bioruptor做超声。结果一
: 样的引物ChIP-qPCR没显著性差异。
: 想了想，感觉是在超声之后，离心一把，发现lysate里有些白色漂浮的不溶絮状物，离
: 心也沉不到管底。
: 记得原来冻过的蛋白有时候化了会析出来这样的絮状物，怀疑是不是超声太猛把蛋白给
: 析出来了。
: 超声条件是30s on，30s off，总共30个cycle。。。
: 求大神给指点指点。。。。
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y*****a
发帖数: 6 | 5 多谢提醒，很有这个可能，我在sonication的时候用了0.1% SDS，然后超声完了lysate
就在4度离心了，离心完看到的。只是不懂0.1% SDS这个量算高算低啊，要是析出来能
看到么。。。
【在 g********6 的大作中提到】
: 可能是SDS
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y*****a
发帖数: 6 | 6 input的Ct值在22左右啊，用genomic DNA做了标准曲线Ct值依次大概是25,28，31吧，
这样判断应该超声后的片段是扩增是没有问题的啊。。。还有之前超声其实做了条件优
化，差不多30 cycle的话，跑胶看主要富集在200-600bp吧，当然没用定量机子看片段
大小具体分布。。。
【在 k*******n 的大作中提到】
: 同意楼上分析，DNA打成太小BP的碎片就不能再拉PCR了。你在超声破碎之后上清液处理
: 一下直接用引物拉一次PCR看看，顺便摸摸条件，免得浪费抗体。
: [在 yinyeya (yinyeya) 的大作中提到：]
: ：
: ：之前博后用超声仪ChIP结果好好滴。。。。
: ：...........
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y*****a
发帖数: 6 | 7 您用这么少的cycle数啊。。。
我估计你用的是bioruptor Pico吧，我用的是bioruptor Plus。看说明书，Pico一般是
6-9cycle，Plus是10-30cycle。。。ES细胞貌似有些robust，超声起来是有些费劲的。
。。
【在 D***a 的大作中提到】
: bioruptor很好用。30cycle太多了，我一般就用6个。
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g*********3
发帖数: 177 | 8 做好chip的关键其实就是sonication+antibody。哥们，你肯定没有仔细读过manual，
如果不肯花时间，还是找个人带吧，或者问有经验的。
1. 你如果读了bioruptor的manual，发现0.1%SDS绝对起不了作用的（甚至他们有专门
卖0.1%SDS的special kit for sonication），因为0.1%太弱了。当然branson的那种
probe，0.1%够了。
2. 单纯考虑多少cycle有意义吗？293和hepg2的cycle完全不一样。不过你用0.1%可能
需要100cycle 都有可能。
3. 30seconds on？？？？你这能有好结果吗？多查查protocol，一般都是10ON+30-40
OFF
4.絮状物？你知道是什么吗？lipids！这个很常见。尤其是你的SDS不够。另外lysis
buffer/cell也不对。 |
y*****a
发帖数: 6 | 9 多谢悉心指点。确实是第一回搞ChIP，而且用bioruptor，按理这应该很好用的。博后
被push的忙的没时间，而且新实验室，说实话ChIP也还在摸索中。
我在IP之前做了sonication的条件优化，确实是发现0.1%SDS+30cycle是最好
sonication效率，这里不知道怎么上图啊，您能看看我sonication的图指点指点就好啦。
其次，具体分析结果的话，我用了多对primer检测，对大部分来说抗体 IP和IgG IP差
距就1个cycle吧，换算成%input，分别是0.03%和0.02%。
再次，我是在ES细胞里用Oct4的抗体拉，用的抗体很多paper都用，应该是验证了很多
次的比较靠谱的，当然在我们这个实验室还在摸索。
最后呢，你分析的很对，很可能是lipids，那它对最后结果分析有影响么？
我现在分析可能原因，一是细胞不够，用了3 million去IP的（这个也是manual上推荐
的），但是看很多paper比这多啊；二是IP buffer是不是不对，抗体和lysate没结合上
。我是先lysate和抗体抚育过夜，在上G beads大概4小时吧，buffer就是shearing用的
buffer。
40
【在 g*********3 的大作中提到】
: 做好chip的关键其实就是sonication+antibody。哥们，你肯定没有仔细读过manual，
: 如果不肯花时间，还是找个人带吧，或者问有经验的。
: 1. 你如果读了bioruptor的manual，发现0.1%SDS绝对起不了作用的（甚至他们有专门
: 卖0.1%SDS的special kit for sonication），因为0.1%太弱了。当然branson的那种
: probe，0.1%够了。
: 2. 单纯考虑多少cycle有意义吗？293和hepg2的cycle完全不一样。不过你用0.1%可能
: 需要100cycle 都有可能。
: 3. 30seconds on？？？？你这能有好结果吗？多查查protocol，一般都是10ON+30-40
: OFF
: 4.絮状物？你知道是什么吗？lipids！这个很常见。尤其是你的SDS不够。另外lysis
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s**2
发帖数: 1287 | 10 搭车问下高手：
我把细胞悬浮在 1% SDS 的 buffer 里准备超声时，在冷室里 SDS 就析出了（我的 10
% SDS 储液在室温也会析出 -- 是不是有问题）。有没有什么解决办法？
谢谢！
40
【在 g*********3 的大作中提到】
: 做好chip的关键其实就是sonication+antibody。哥们，你肯定没有仔细读过manual，
: 如果不肯花时间，还是找个人带吧，或者问有经验的。
: 1. 你如果读了bioruptor的manual，发现0.1%SDS绝对起不了作用的（甚至他们有专门
: 卖0.1%SDS的special kit for sonication），因为0.1%太弱了。当然branson的那种
: probe，0.1%够了。
: 2. 单纯考虑多少cycle有意义吗？293和hepg2的cycle完全不一样。不过你用0.1%可能
: 需要100cycle 都有可能。
: 3. 30seconds on？？？？你这能有好结果吗？多查查protocol，一般都是10ON+30-40
: OFF
: 4.絮状物？你知道是什么吗？lipids！这个很常见。尤其是你的SDS不够。另外lysis
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g*********3
发帖数: 177 | 11 正常。SDS is pretty sensitive to salt and Temperature.
the optimal temperature we have optimized for 1%sds sonication is 17 degree.
Others have reported this too.
Even if people claimed 4degree sonication (pump-cold water circulation),
the actual temperature is ~17degree.
We always dissolve nuclei in lysis buffer right before the sonication to
avoid the long stand of 1%sds+nuclei on ice, which will precipitate.
10
【在 s**2 的大作中提到】
: 搭车问下高手：
: 我把细胞悬浮在 1% SDS 的 buffer 里准备超声时，在冷室里 SDS 就析出了（我的 10
: % SDS 储液在室温也会析出 -- 是不是有问题）。有没有什么解决办法？
: 谢谢！
:
: 40
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s**2
发帖数: 1287 | 12 devil is in the details. 果然是高人！
那循环水的温度，我是应该设成4C还是17C呢？
我每个cycle 用15sec ON / 45sec OFF，到cycle后期似乎就能看到一点点SDS沉淀开始
析出。
多谢指教！
degree.
【在 g*********3 的大作中提到】
: 正常。SDS is pretty sensitive to salt and Temperature.
: the optimal temperature we have optimized for 1%sds sonication is 17 degree.
: Others have reported this too.
: Even if people claimed 4degree sonication (pump-cold water circulation),
: the actual temperature is ~17degree.
: We always dissolve nuclei in lysis buffer right before the sonication to
: avoid the long stand of 1%sds+nuclei on ice, which will precipitate.
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