t*****z
发帖数: 1598 | 1 如题，有些啰嗦，诸位好心的看官如果课题紧张的话，只看题目就行啦。
我在做一个最最常规的把插入序列连接到载体里面的分子克隆实验。插入片段两边的酶
切位点是BamHI和XbaI，载体当中的酶切位点是BglII和KpnI。其中BamHI和BglII是匹配
的，可以连接，但是XbaI和KpnI不匹配。但是我为了赶时间，打算强行连接了。我注意
到KpnI是平端。我想先把XbaI用Klenow片段修平了，再连接到KpnI的平端上去。我的具
体实验设计如下：
把插入序列和载体用T4连接酶连接一段时间（连接BglII和BamHI末端），然后把T4连接
酶加热失活，然后加入Klenow片段（他们的缓冲液相互兼容），反应一段时间（把XbaI
末端补平），加热失活，再加入T4连接酶，反应更长的时间（把两个平端相连），最后
转化。
这个方案不知可行否？成功率大不大呢？可以做什么样的改进呢？
另外我对T4连接酶的效率比较好奇。以前读书的时候，都是连接过夜，至不济也要连接
四个小时。可是现在的T4连接酶的说明书上，都只要五分钟十分钟的，是现在的酶果真
都那么强吗？各位平时做连接都连接多久呢？
谢谢各位！ |
p****p
发帖数: 3360 | 2 1. KpnI 不是bunt end。
2. 如果可能，先切KpnI和XbaI，klenow修平，再切BamHI和BglII。走胶切割纯化，连
接。
XbaI
【在 t*****z 的大作中提到】
: 如题，有些啰嗦，诸位好心的看官如果课题紧张的话，只看题目就行啦。
: 我在做一个最最常规的把插入序列连接到载体里面的分子克隆实验。插入片段两边的酶
: 切位点是BamHI和XbaI，载体当中的酶切位点是BglII和KpnI。其中BamHI和BglII是匹配
: 的，可以连接，但是XbaI和KpnI不匹配。但是我为了赶时间，打算强行连接了。我注意
: 到KpnI是平端。我想先把XbaI用Klenow片段修平了，再连接到KpnI的平端上去。我的具
: 体实验设计如下：
: 把插入序列和载体用T4连接酶连接一段时间（连接BglII和BamHI末端），然后把T4连接
: 酶加热失活，然后加入Klenow片段（他们的缓冲液相互兼容），反应一段时间（把XbaI
: 末端补平），加热失活，再加入T4连接酶，反应更长的时间（把两个平端相连），最后
: 转化。
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b******k
发帖数: 1874 | 3 赞。
【在 p****p 的大作中提到】
: 1. KpnI 不是bunt end。
: 2. 如果可能，先切KpnI和XbaI，klenow修平，再切BamHI和BglII。走胶切割纯化，连
: 接。
:
: XbaI
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z*******a
发帖数: 175 | 4 I would go with pentip's strategy with one exception: use T4 polymerase to
blunt Kpn1. |
t*****z
发帖数: 1598 | 5 谢谢你的指点。KpnI那个是我自己搞错了。你的方法看起来更加可靠些。我来试试看吧。
【在 p****p 的大作中提到】
: 1. KpnI 不是bunt end。
: 2. 如果可能，先切KpnI和XbaI，klenow修平，再切BamHI和BglII。走胶切割纯化，连
: 接。
:
: XbaI
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t*****z
发帖数: 1598 | 6 多谢你的建议！这一节我不大明白，T4 polymerase和Klenow的功效有哪些差别呢？什
么时候该选用哪种呢？
【在 z*******a 的大作中提到】
: I would go with pentip's strategy with one exception: use T4 polymerase to
: blunt Kpn1.
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f**u
发帖数: 346 | 7 借地方问个问题。
Klenow到底为什么能修平？这个方法我是听前辈们说的，
是因为它的polymerase活性补平吗？如果是的话我做的时候是酶切产物直接加Klenow，
里面也没加dNTP，怎么可能给补平呢？
或者用的是它的exonuclease活性给切平？但是对于Klenow来说这个已经没有了。
还是说Klenow有多种不同的exonuclease活性？
另外不管是哪一个，好像对于5'粘端和3'粘端都是不一样的，
但我已经糊里糊涂地做过很多了，好像也没出过问题。
有人知道问题的答案吗？
【在 p****p 的大作中提到】
: 1. KpnI 不是bunt end。
: 2. 如果可能，先切KpnI和XbaI，klenow修平，再切BamHI和BglII。走胶切割纯化，连
: 接。
:
: XbaI
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h*****9
发帖数: 4028 | 8 找本NEB的catalog看一下，一切都一目了然了。
【在 f**u 的大作中提到】
: 借地方问个问题。
: Klenow到底为什么能修平？这个方法我是听前辈们说的，
: 是因为它的polymerase活性补平吗？如果是的话我做的时候是酶切产物直接加Klenow，
: 里面也没加dNTP，怎么可能给补平呢？
: 或者用的是它的exonuclease活性给切平？但是对于Klenow来说这个已经没有了。
: 还是说Klenow有多种不同的exonuclease活性？
: 另外不管是哪一个，好像对于5'粘端和3'粘端都是不一样的，
: 但我已经糊里糊涂地做过很多了，好像也没出过问题。
: 有人知道问题的答案吗？
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