w*******r
发帖数: 23 | 1 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
都是70多KD，查了文献，也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解，求高手解惑。万
分感谢！ |
a*****n
发帖数: 2835 | 2 有时候marker不一定准确，买到抗体验证一下相互作用吧
pull
【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
: 都是70多KD，查了文献，也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解，求高手解惑。万
: 分感谢！
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w*******r
发帖数: 23 | 3 应该不是marker的问题，质谱分析结果里丰度排在那个70KD蛋白下面的就有一个60KD左
右的蛋白还有一个50多KD的蛋白。如果从跑胶结果看的话，那个切下来的条带离70还很
远呢，不可能有70多KD。Anyway, 谢谢回复啊。
【在 a*****n 的大作中提到】
: 有时候marker不一定准确，买到抗体验证一下相互作用吧
:
: pull
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A******y
发帖数: 2041 | 4 Who cares? Your MS is biased anyway. Just do further molecular biology to
validate your pull-down. Also, did you run a midi-gel or mini-gel? If you
run a mini-gel, your gel resolution might not be high enough that you can
cut close enough to isolate specific MW proteins. Run a midi-gel might help.
pull
【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
: 都是70多KD，查了文献，也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解，求高手解惑。万
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p****p
发帖数: 3360 | 5 Have you looked at the protein to see if there's a signal peptide?
pull
【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
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o**4
发帖数: 35028 | |
I*****y
发帖数: 6402 | 7 70KD的蛋白可能跑低了，60KD的蛋白有可能跑到80KD啊，这个不能一概而论。如果你切
的没错，质谱的结果就靠谱
pull
【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
: 都是70多KD，查了文献，也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解，求高手解惑。万
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w*******r
发帖数: 23 | 8 如果是这样的话，难道这个药同时结合了至少3种蛋白？！因为这个70KD的蛋白和另外
两个60KD的蛋白在control里完全没检测到，只在pull down里才有。
【在 I*****y 的大作中提到】
: 70KD的蛋白可能跑低了，60KD的蛋白有可能跑到80KD啊，这个不能一概而论。如果你切
: 的没错，质谱的结果就靠谱
:
: pull
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K******S
发帖数: 10109 | 9 I would say you are extremely lucky if your drug can only interact with 3
unique proteins. The whole workflow is called chemical proteomics and it's a
very mature workflow. The only purpose of running a gel is to do some crude
separation. Majority of ppl cut out the whole lane and use MS to detect
everything then compare.
【在 w*******r 的大作中提到】
: 如果是这样的话，难道这个药同时结合了至少3种蛋白？！因为这个70KD的蛋白和另外
: 两个60KD的蛋白在control里完全没检测到，只在pull down里才有。
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s******s
发帖数: 13035 | 10 PAGE上的size不能当真理。再说，还可能有很多neg charge的modification
pull
【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
: 都是70多KD，查了文献，也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解，求高手解惑。万
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A******y
发帖数: 2041 | 11 Watch it is going to be tubulin... |
W****7
发帖数: 426 | 12 1 蛋白跑得远近不只是看分子量，还要看charge的，还有，也不是所有的修饰都是使蛋
白跑的更慢，也有让蛋白跑得快的。
2 你pull down的蛋白也许有degradation。。。
3 蛋白marker有时候真的不准。。。
所以，以质谱结果为准，既然有了结果，就无论如何都要验证下去。。。
good luck！ |
b*********0
发帖数: 4 | 13 1. 那个70多kD 是根据amino acid sequence推算出来的理论值，不是真正在gel
migration上的位置。
2. 同样的蛋白用同样的ladder在不同的gel(invitrogen bis-tris, Bio-rad Tris-
glycine 系统上跑出来的都可能差10kD左右。）
3. MS给出的结果一般是比较靠谱的，尤其是SC（spectrum counts, e.g., sequenced
times）
4. 如果能弄到相关抗体的话， 可以做个western就可以确认了。 |
T****O
发帖数: 407 | 14 1) 质谱丰度受仪器条件影响非常大，不应单独作为定量判据。
2) 任何分离方法都不是绝对的。
比如你的60带里残留很少的70，仅能被质谱检出。而恰好在当时的质谱条件下，检测器
抓到了更多的70离子。
pull
【在 w*******r 的大作中提到】
: 我试验目的是找到药物的靶标。control是beads，实验组是用biotinylated drug pull
: down 细胞裂解液中的靶蛋白。在60KD左右发现了一条只出现在pull down sample里的
: 条带。于是，我把60KD的带切下来送去做质谱。可分析结果中丰度最大的却是一个70多
: KD的蛋白，这是怎么回事？如果是个小于60KD的蛋白，那么还可能是翻译后修饰导致的
: 。但为什么我明明在60KD切下的胶，会有70多KD的蛋白呢？这个蛋白有两个isoform，
: 都是70多KD，查了文献，也没有什么剪切处理的产物。百思不得其解，求高手解惑。万
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