B****w
发帖数: 48 | 1 RT
我有一个长3KB的转录因子，中间的1000-2000是DNA binding domain。我想对中间
的1000-2000 DNA binding domain用PCR构建突变体库,两端的序列（1-1000和2000-
3000）保持不变。不知道有什么好办法？
谢谢！ |
m**p
发帖数: 2471 | 2 最直接的，epPCR
RT我有一个长3KB的转录因子，中间的1000-2000是DNA binding domain。我想对中间的
1000-2000 DNA binding domain用PCR构建........
【在 B****w 的大作中提到】
: RT
:
: 我有一个长3KB的转录因子，中间的1000-2000是DNA binding domain。我想对中间
: 的1000-2000 DNA binding domain用PCR构建突变体库,两端的序列（1-1000和2000-
: 3000）保持不变。不知道有什么好办法？
: 谢谢！
|
s********n
发帖数: 2939 | 3 在#1000和#2000左右处引入限制性酶切位点，切掉#1000-2000的片段作为载体，用
epPCR扩增#1000-2000这个片段，酶切后再连上之前的载体就可以了。
【在 B****w 的大作中提到】
: RT
:
: 我有一个长3KB的转录因子，中间的1000-2000是DNA binding domain。我想对中间
: 的1000-2000 DNA binding domain用PCR构建突变体库,两端的序列（1-1000和2000-
: 3000）保持不变。不知道有什么好办法？
: 谢谢！
|
H*******i
发帖数: 196 | 4 按照楼上方法
可以用BsaI或者同类酶设计酶切位点，这样对你的基因功能没有影响。 |
s********n
发帖数: 2939 | 5 还有一个更简单的方法就是先用epPCR扩增#1000-2000的片段，然后用这个产物作
primer，直接扩增整个质粒，第二步要用高保真的酶，就相当于QuikChange |
B****w
发帖数: 48 | |
B****w
发帖数: 48 | 7 刚刚试了一下！好像不行呀！出来的都是Smear.用的酶是phusion, 94度变性，72度退
火延伸。
【在 s********n 的大作中提到】
: 还有一个更简单的方法就是先用epPCR扩增#1000-2000的片段，然后用这个产物作
: primer，直接扩增整个质粒，第二步要用高保真的酶，就相当于QuikChange
|
