e**e
发帖数: 166 | 1 我的蛋白是高尔基体上膜蛋白复合体。大概４００－５００Dka。
我用NP４０ 溶解后，用６０％的（NH４）２SO４沉淀可以得到６０％的活性。 现在
过分子筛柱。
我有个（LKB Triacryl GF２００）的柱子 （１。６ x ６０cm） （１２０，０００－
１５，０００，０００）。 我用Hepes buffer （１ml／min的流速。 我在用Blue
Dextran （MW ２，０００，０００）和BSA 的时候， 发现他们同时一起出来了。
这个柱子可以分离吗？ 还有别的建议吗？ |
e****s
发帖数: 1125 | 2 不是完全看懂了。
你应该是问分子筛能不能用来分离你这个大的Complex,是从cell lysate还是纯蛋白
reconstructed的complex?
如果是salt cut 后的样品直接上gel filtration, 应该是不行的。 分子筛通常也极少
用于第一步的初提。
如果是pure protein重构的复合物，那就看单体的大小了。明显BSA左右的蛋白 （~
60kd?）是分不开的，都在死体积里出来了。
【在 e**e 的大作中提到】
: 我的蛋白是高尔基体上膜蛋白复合体。大概４００－５００Dka。
: 我用NP４０ 溶解后，用６０％的（NH４）２SO４沉淀可以得到６０％的活性。 现在
: 过分子筛柱。
: 我有个（LKB Triacryl GF２００）的柱子 （１。６ x ６０cm） （１２０，０００－
: １５，０００，０００）。 我用Hepes buffer （１ml／min的流速。 我在用Blue
: Dextran （MW ２，０００，０００）和BSA 的时候， 发现他们同时一起出来了。
: 这个柱子可以分离吗？ 还有别的建议吗？
|
e**e
发帖数: 166 | 3 谢谢你的答复
我的蛋白复合体是植物组织中提取的天然蛋白。 我测到其中的一个糖基转移酶活性很
高，所以想纯化出来做proteomics. 我的设想是cell lysate 做盐析，然后过sec gel
filtration
最后做离子交换柱。 请问你有什么好的建议吗？
谢谢 |
e****s
发帖数: 1125 | 4 你的复合物是什么概念，会这么稳定？！
比如离子柱要用高盐洗脱，高盐会不会破坏你的复合物呢？
Anyway,如果是分子筛+离子的话，我会先试离子柱子，然后分子筛。
离子柱子有很好的浓缩作用，如果盐析没有对纯度有太大帮助的化，直接上离子柱子。
反过来，分子筛比较时候最后的精细纯化。你的样品体积不能太大，量不能太高。所以
，分子筛不适合当第一个柱子，样品太脏。
gel
【在 e**e 的大作中提到】
: 谢谢你的答复
: 我的蛋白复合体是植物组织中提取的天然蛋白。 我测到其中的一个糖基转移酶活性很
: 高，所以想纯化出来做proteomics. 我的设想是cell lysate 做盐析，然后过sec gel
: filtration
: 最后做离子交换柱。 请问你有什么好的建议吗？
: 谢谢
|
e**e
发帖数: 166 | 5 你的建议很好。 我的蛋白复合体应该是二硫键结合的。 我的蛋白盐析以后用PD１０去
盐， 浓缩用Amicon。 活性保持的还可以。所以离子柱应该不会破坏蛋白。
请问离子柱和分子筛你有什么推荐的产品吗？ |
