r**********e
发帖数: 587 | 1 想对大概200bp的oligo template做in vitro transcription
我的目的就是，对oligo进行突变，比如一个A，一个C， 然后做IVT， 然后就简单的
nanodrop测量RNA yield；来观察A/C对transcription的影响
protocol上说对于short template，IVT可能有点困难。我想请问为啥呢？因为
polymerase很大，polymerase initiation需要一定的空间距离？而200bp太短？
我的目标并不是追求max yield，我的目标是比较A和C的yield区别。但是，因为200bp
长度太短，我不知道用200bp做IVT比较yield，是否严谨？ |
m******u
发帖数: 12400 | 2 200nt 不算短，可以比较好转录。但也要看你需要。Nanodrop定量不准，因为free
nucleotide干扰，需要先除去。简单沉淀不能去除free nucleotide。要用柱子。
IVT另一个问题是不纯。短的模板会产生不依赖模板的序列，这倒不简单是因为
polymerase太大的缘故。有时polymerase会bend回来继续转绿，形成回文的转录产物。
长的产物会不能合成到底，产生短的不完整产物，这个也很麻烦。 |
m******u
发帖数: 12400 | 3 所以还要要看你下游需要，来做判定纯度是不是很重要。 |
r**********e
发帖数: 587 | 4 很感激
我做了200nt oligo为template的IVT，压根不work
而PCR product作为template还可以
我不知道是我技术的问题，还是oligo本来就很难work呢？
【在 m******u 的大作中提到】
: 200nt 不算短，可以比较好转录。但也要看你需要。Nanodrop定量不准，因为free
: nucleotide干扰，需要先除去。简单沉淀不能去除free nucleotide。要用柱子。
: IVT另一个问题是不纯。短的模板会产生不依赖模板的序列，这倒不简单是因为
: polymerase太大的缘故。有时polymerase会bend回来继续转绿，形成回文的转录产物。
: 长的产物会不能合成到底，产生短的不完整产物，这个也很麻烦。
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m******u
发帖数: 12400 | 5 RNA polymerase一般需要双链template---assume大家用的是T7或SP6的polymerase。你
200nt template指的是单链模板么？至少promoter区要双链的。
而PCR产物则是双链的，你的问题会不会是这个原因。
发信人: reallyloveme (ray), 信区: Biology
标 题: Re: in vitro transcription for short template
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 20 12:46:24 2017, 美东)
很感激
我做了200nt oligo为template的IVT，压根不work
而PCR product作为template还可以
我不知道是我技术的问题，还是oligo本来就很难work呢？ |
r**********e
发帖数: 587 | 6 我哭。。。
你说的太对了。。。。
非常感谢！
我的分子生物学，白学了
【在 m******u 的大作中提到】
: RNA polymerase一般需要双链template---assume大家用的是T7或SP6的polymerase。你
: 200nt template指的是单链模板么？至少promoter区要双链的。
: 而PCR产物则是双链的，你的问题会不会是这个原因。
: 发信人: reallyloveme (ray), 信区: Biology
: 标 题: Re: in vitro transcription for short template
: 发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 20 12:46:24 2017, 美东)
: 很感激
: 我做了200nt oligo为template的IVT，压根不work
: 而PCR product作为template还可以
: 我不知道是我技术的问题，还是oligo本来就很难work呢？
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r**********e
发帖数: 587 | 7 另外再请教一下
用于IVT的oligo, 纯度要求如何？
一定要订 ultra-pure的么？
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补充一下，因为要订200bp的比较长的oligo，所以我一直用的是idt ultra-pure：
https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/ultramer-oligos
刚才查了一下，貌似IDT没法order 200nt的duplexed oligo
看来只能老实PCR了
【在 m******u 的大作中提到】
: RNA polymerase一般需要双链template---assume大家用的是T7或SP6的polymerase。你
: 200nt template指的是单链模板么？至少promoter区要双链的。
: 而PCR产物则是双链的，你的问题会不会是这个原因。
: 发信人: reallyloveme (ray), 信区: Biology
: 标 题: Re: in vitro transcription for short template
: 发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 20 12:46:24 2017, 美东)
: 很感激
: 我做了200nt oligo为template的IVT，压根不work
: 而PCR product作为template还可以
: 我不知道是我技术的问题，还是oligo本来就很难work呢？
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v********a
发帖数: 646 | 8 我做过70个碱基的ivt，觉得产量还行。
但是产物必须Urea PAGE切胶纯化，用Qubit HS DNA kit 定量。 |
