s******s
发帖数: 13035 | 1 是cDNA里面有重复，还是你的primer在重复区？
我以前p过一下里面无数重复序列的amplicon，没啥问题；要是你的primer有问题，
可以做一个nested, 外面p好克隆好，然后换你的引物 |
|
b****r
发帖数: 17995 | 2 或者直接买openbiosystem之类公司的cDNA clone然后切得了，折腾啥 |
|
I***W
发帖数: 218 | 3 主要是觉得这个cDNA不应该在这种组织里出现，所以才怀疑是不是污染了其他的东东。
我在调整一下Blast的参数试一下。
Thanks a lot! |
|
h****k
发帖数: 182 | 4 起始浓度要调成一样吗？调RNA还是cDNA. 比较不同组织。 |
|
|
i***l
发帖数: 1656 | 6 RT酶的能力有限 至少你的Input不能一个1 一个100吧，不然100那个的CDNA 不会靠谱
儿的 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 7 在排除样品质量的情况下
用RNA ligase mediated 5'RACE得到的transcription starting site和最早报道的用
cDNA library测序得到的starting site很不一样 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 8 重复了很多次，也用commercial available的RNA重复过了
我用的RACE得到的TSS更靠3‘端，另外，我用的RACE是5'cap dependent的，所以原理
上更可能直接和translation product有关
我比较想知道cDNA library那个特别长的RNA isoform是哪来的，后来再也没人重复过
，junk product? |
|
E*****e
发帖数: 54 | 9 克隆好几个基因，RT-PCR能检测到基因表达 （ct～29， GAPDH ct～18），但用PCR （
35 cycle）一个都没能克隆出来。
请教一下从自制cDNA文库中克隆基因有什么窍门吗？ |
|
b********2
发帖数: 125 | 10 希望clone一段Eukaryote organism gene到其他的方便表达的receptor hosts.
查到有个kit, Superscript Plasmid system with Gateway for cDNA synthesis and
cloning. 是个好的选择吗？
这个kit里面用到了32P-dCTP，不用可以吗？有什么其他方法一样可以计算yield和size
?比如为什么不用nanodrop?
万分感谢！ |
|
l******g
发帖数: 1623 | 11 不想做广告，你随便用你origene里的RefSeq ID 加上 “cDNA clone“或者类似字样，
google一下，会有很多公司在卖 |
|
n*******9
发帖数: 234 | 12 Yes, if you use SYBR, the diluted cDNA will postpone Ct value 3.32 |
|
b*******H
发帖数: 830 | 13 有谁能提供一些编码protein A (SpA）的质粒或cDNA 或相关信息，将不胜感激。 |
|
c******t
发帖数: 108 | 14 今天被lab mate 问到合成first strand cDNA的原理，发现自己以前确实没想太多。
请教大家呀：
我们用的是M-MLV，
1. 一开始的65度5分钟到底是为了打开mRNA的二级结构，还是为了打开二级结构加配对
oligo dT? 2. 65度后立马冰浴的时间要多长？目的是让打开二级结构后的mRNA保持状
态，还是使oligo dT引物与RNA配对？
3. 最后的80度5分钟是只为了灭活酶活性，还是还有别的意义？
4. 看到有些protocol说要加DTT，意义在何处？
5. 在哪个权威网站或database比较容易找到一些实验的原理精解？
多谢啊！ |
|
m********2
发帖数: 317 | 15 要克隆１０００个cDNA到一个质粒，
国内哪家公司信价比比较好 |
|
t*******k
发帖数: 87 | 16 从公司买了个组织特异性cDNA文库，从介绍看就是mRNA的反转录产物，没有克隆到质粒
里。
不知这个东西稳定性怎么样，室温放24小时会不会坏？ |
|
y*****u
发帖数: 31 | 17 用cDNA 做了一个library送去SEQ,因为浓度比较稀，就用45°C vacuum这个library
mixture 2个多小时，
然后就装入干冰寄走了。请问这样45°vacuum然后室温，再直接装入干冰会不会损害样
品？谢谢。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 18 多数老鼠的cDNA应该能买到。记得以前有个某大学某center啥的，可以买
gateway的基因， 好像也就一百多一个，回来gateway一下，两个礼拜病毒就好了 |
|
B*******c
发帖数: 5056 | 19 放了好几年的一组sample，忘了是RNA还是cDNA了，
请问如何快速分辨？
谢谢 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 20 反转录的时候，如果random hexamer做引物，当它碰到另外一个模板上结合的hexamer
时候，就会自动终止。所以如果你是拿来做克隆的模板，最好单独用oligo dT做模板搞
出来的cDNA。如果非要用random hexamer，量要控制好，不要太多。 |
|
发帖数: 1 | 21 啊哈！我觉得就是这个！我用的是iscript cDNA first-strand kit, 它提供的是
oligodt 和 hexamer的mix.我明天就去订一个只有oligoDt的kit.
另外我想问一下，我有个gene它有6500bp左右长度。在做反转录的时候，您觉得反转的
时间大概需要多久。Biorad说在42℃上放60-90分钟。您觉得够嘛？
hexamer |
|
s*******h
发帖数: 82 | 22 我们原来都是自己做。有几个关键，基因的长度和表达丰度，如果在3k以内，表达丰度
高，那很好做。如果太长就不好办了，可以试着分片段克隆，再拼起来，很费精力。如
果表达丰度太低，那就选个高的细胞系。有专门的反转录酶可以得到长的cDNA，也可以
试一下，不能保证。 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 23 我记得很久以前看过一个protocol，貌似说反转录60分钟，4kb的没有问题。 我自己做
都是搞120分钟，这个应该没啥坏处。
以前搞过一个6kb多的epigenetic factor，真心不好搞，最后分了4段做overlap PCR才
搞出来了。如果你的目的基因丰度又低，片段又长，真的会很难搞。 最好买个cDNA回
来搞吧。 如果实在不想花那么多钱，做overlap也可以，但是不要搞酶切位点的链接，
用同源重组的链接，这样设计引物自由度会大很多。 |
|
h***e
发帖数: 7320 | 24 找个酶切位点，分别克隆试试看，可能还是在你的cDNA里面表达量不高
所以克隆不出来 |
|
发帖数: 1 | 25 请问各位有没有好的cDNA clone公司推荐。
现在想克隆一条lncRNA 求哪里比较有完全的full length的DNA库？
谢谢大家！ |
|
|
c*********d
发帖数: 9770 | 27 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
|
T**********e
发帖数: 29576 | 28 人类基因不能专利， 但是cDNA可以专利。这个决定很让人奇怪。
A victory for genes
Nature Medicine (2013)
he decision has been a long time in coming—so long that Myriad's patents
were due to expire in less than three years. And the 15-year delay has
surely not aided patients who frequently benefit from healthy competition in
the biotech sector or from research on BRCA genes. Yet the decision brings
relief to those of us who reject the idea that an individual or corporation
can own—even for a limited time—human genes and there... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 29
Download pdf published by SfN (Chapter from 'The History of Neuroscience in
Autobiography, Volume 8' edited by Larry R. Squire)
Yuh-Nung Jan's CV
Lily Jan's CV
Yuh-Nung Jan and Lily Jan
Birth
Family History and Growing Up
National Taiwan University
The Hiking Trip to Shitou in the Spring of 1967
Graduate School Application
Graduate Study at Caltech (1968锟974)
Seymour Benzer Lab (1974锟977)
Steve Kuffler锟絪 Lab at H... 阅读全帖 |
|
g******r
发帖数: 139 | 30 OK,what you mean is the cDNA concentration used should be in the linear
region of the reaction.
This concentration would vary for each of the genes, dependent on the
abundance. I did not perform such cDNA dilution pilot experiment for each
gene. I just used 2-4 ng cDNA in the real-time PCR. One would assume the
gene with Ct of 25-31 is within the linear range, if the Ct is >33, it is
possible the cDNA conc is kind of out the range.
And it is true as Isaid that I got no outlier replicates for gen... 阅读全帖 |
|
m******n
发帖数: 194 | 31 ok, 简单说一下：
DNA:
cDNA: is a single-stranded DNA complementary to an RNA, synthesized from mRNA
by reverse transcriptase from mRNA.
genomic DNA: DNA of the genome
(big different between cDNA and genomic DNA is in eukaryotes, genomic DNA
has a lot of junk (non-coding seq, satalitte DNA, etc) DNA.
while cDNA only contains the coding region.)
cDNA is used extensively to make cDNA library.
RNA:
mRNA: message RNA, RNA that codes for protein sequence.
tRNA: transfer RNA, about 70-120base pairs, used in |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 32 1.可能没有全长cDNA
2.可能有全长cDNA，但是用的DNA polymerase没办法从你的模板里p 9kb
解决方法可以有
1.如果对cDNA质量有怀疑，重新制备
2.换DNA polymerase，我用过TAKARA的LA DNA polymerase，不过模板不是cDNA，是细
菌gDNA，
扩了13kb。模板是细菌gDNA还是人/老鼠 gDNA还是cDNA还有区别的，可以参考他们网站
3.既然小段的可以P出来，就重新设计引物，分两段或者分三段甚至四段扩，（互相
overlap)分别扩
好了以后再做mega PCR |
|
C*******e
发帖数: 4348 | 33 看了一下，那个kit里面还是用的dT-anchor primer来做cDNA synthesis的
很大程度上这一步的效率取决于这个VTTTT-anchor primer跟poly-A tail的结合程度
我个人觉得既然你现在做不出来
很有可能是cDNA synthesis这一步就已经效率很低
我当时做RLM-3’RACE的一个原因就是原核没有poly-A tail
没有办法用poly-T的primer来做cDNA synthesis这一步
RLM-3'RACE带来的好处是
mRMA3'连上adaptor以后
后面的cDNA synthesis用的是adaptor specific oligomer
这个效率会有不同
如果已经山穷水尽，这个结果又一定要做出来
可以试试这个RLM-RACE的方法
不过就是多设计个引物，买点T4 RNA ligase而已
Roche的反转录酶还是不错的
～～～～～～～～～～～～～～～～～
另外如果你担心是因为mRNA的二级结构有影响的话
在把RNA加入cDNA synthsis反应之前
可以95度加热RNA3分钟，然后立刻放在冰上，冷却以后再用 |
|
j****1
发帖数: 63 | 34 cDNA应该是国人吧，zhang也是国人，
zhang的文章先到science，结果被cDNA给据了；后来到了cell research，cDNA不爽了
，于是在nature bio孟山都的文章中打张，其声丝竭力状即所作的努力连鬼子都比不过。
所以，应该是中国人打中国人的脸，左右互搏。
cDNA的行为有点像不像汉奸？他（她）说不是，因为他（她）说它是举着科学的旗号的，
但很多人又说是，因为孟山都是鬼子的，所以，到底是不是呢？cDNA是汉奸。 |
|
d***n
发帖数: 12 | 35 寻找Genomics方面的专家
我们也想借未鸣空间的宝地，公开求贤，寻找Genomics方面的专家，共同创业。
专业方向:
Next Gen DNA sequencing
Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard and FLX Titanium
Solexa technology
Applied Biosystems SOLiD
Whole Genome Analysis
PCR Amplicon Sequencing
Metagenomics
Transcriptomics
Small RNA Analysis
Epigenetics
Genome sequencing and re-sequencing
ABI 3730xl, 3130xl
Amersham MegaBACE 4000 and 1000
文库构建
cDNA libraries (including standard cDNA library, large insert cDNA library,
normalized cDNA library and subtracted c |
|
d***n
发帖数: 12 | 36 寻找Genomics方面的专家
我们也想借未鸣空间的宝地，公开求贤，寻找Genomics方面的专家，共同创业。
专业方向:
Next Gen DNA sequencing
Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard and FLX Titanium
Solexa technology
Applied Biosystems SOLiD
Whole Genome Analysis
PCR Amplicon Sequencing
Metagenomics
Transcriptomics
Small RNA Analysis
Epigenetics
Genome sequencing and re-sequencing
ABI 3730xl, 3130xl
Amersham MegaBACE 4000 and 1000
文库构建
cDNA libraries (including standard cDNA library, large insert cDNA library,
normalized cDNA library and subtracted c |
|
d***n
发帖数: 12 | 37 寻找Genomics方面的专家
我们也想借未鸣空间的宝地，公开求贤，寻找Genomics方面的专家，共同创业。
专业方向:
Next Gen DNA sequencing
Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard and FLX Titanium
Solexa technology
Applied Biosystems SOLiD
Whole Genome Analysis
PCR Amplicon Sequencing
Metagenomics
Transcriptomics
Small RNA Analysis
Epigenetics
Genome sequencing and re-sequencing
ABI 3730xl, 3130xl
Amersham MegaBACE 4000 and 1000
文库构建
cDNA libraries (including standard cDNA library, large insert cDNA library,
normalized cDNA library and subtracted c |
|
c****1
发帖数: 1095 | 38 测cDNA的拷贝数是没有问题的，可以用一系列已知拷贝数的DNA为摸版作标准曲线。现
在问题的关键是，能否用cDNA的拷贝数代替mRNA的拷贝数。根本的问题是：新合成的
cDNA会主动跟RNA解链么？如果可以，RNA可以再次作为摸版合成新的cDNA。这样问题就
出现了。 |
|
Z******5
发帖数: 435 | 39 可能我表述的不完整，不清楚，还是重新说一次。
两个样品--实验组&对照组， 两对引物--目的基因和内参， 假设每个只做一管，不用
做重复，那么最后是4管反应体系。加样顺序有两种：
1，分别加一个2x的 实验组cDNA，qPCR MIX, Dye，H2O 和 对照组cDNA，qPCR MIX，
Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加引物。
2，分别加一个2x的 目的基因引物，qPCR MIX, Dye，H2O 和 内参引物，qPCR MIX，
Dye，H2O， 然后再分别分装成两管，最后分别加cDNA。
我觉得1更合理，但是很多kit的protocol上是最后才加cDNA。 |
|
c******r
发帖数: 3778 | 40 同学，你这个连term都乱用啊
模板是说template，就是你的cDNA。
你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
别。
因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。 |
|
b******i
发帖数: 287 | 41 真是个大好人啊给了这么详细的回复！！！
我觉得能排除cDNA的质量问题，是因为我用同一批的cDNA去做PCR是可以PCR到从ATG到
下游的1.7K片段（其实还没有拿到全长，做出了5RACE，知道了转录起始位点，而CDS全
长2.5K，我设计了很多引物，目前只能拿到1.7K的序列，后面的800bp 怎么尝试都P不
出来，而3'RACE目前也还在努力中），所以我觉得OLIGO DT引物反转录出来的cDNA应该
没有问题吧，5'端ATG部分的序列都有了，那肯定是从3'端走过来的拉，应该走通了啊
。。。。。。 可是为啥就P不出来呢？
或者我应该尝试一下你说的这个RLM KIT，提高cDNA的质量试试！
非常感谢你花时间帮忙解决我的问题！ |
|
W*********n
发帖数: 775 | 42 1） 细胞先转录出带内含子的mRNA, 请问提取RNA后，反转录成cDNA，这个cDNA里面
有没有未成熟的mRNA(intron 没有来得及剪贴掉)反转录出来的？也就是说，反转录DNA
（cDNA）里面，可能含有intron吗？
2） 做一个同源基因的克隆，该基因有三个外显子，在第一个被初步annotated的外
显子上游，可以找到另外2个位点编码Met，可以使蛋白往N末端延伸10个或20个aa。我
假定它是从往上延伸20aa的位点开始翻译，然后设计引物，在cDNA中扩增该基因。结果
显示扩增出来的序列就是3个外显子序列和那上游20aa对应的序列，没有任何内含子。
这是否说明该基因就是从往上游延伸20aa的地方起始翻译的呢？ |
|
r**********e
发帖数: 587 | 43 同问这个问题。
internal control不就是来主要control这个用于qPCR的cDNA的量的么？
cDNA多，内参的值就高；cDNA少，内参的值就低。
当然要保证cDNA在合理的范围内，不能太低也不能太高。
只要在合理浓度范围内，请问用内参有什么问题？有啥bias？ |
|
y*******a
发帖数: 303 | 44 我是在一种genomic information未知的植物里做real-time PCR。此植物为四倍体，且
自交不亲和。一般是先根据同源性设计引物扩部分DNA片段， 然后测序再设计real-
time PCR的引物。拿到引物我会先将Wildtype plant的cDNA用普通PCR仪扩增试一下退
火温度并且跑胶检验40个循环后是否条带单一。确定是单一条带了，会进行大量real-
time实验（Biorad-sybr）。这时悲剧就发生了。有如下一些问题：
1. 同一种cDNA sample的3个技术重复，melting curve不同，有时全是单峰，但不重合
，相差很远；有时3个重复里有单峰也有多峰。
2. 不同cDNA sample之间（WT vs. TG 或者stress treatment at different time
points）melting curve不同，在某个sample里很好全是单峰，在另一sample里就乱了。
3. real-time后跑胶，的确很多带。可是之前用普通PCR扩增，相同program，跑胶是一
条带。
自己的分析是：因为是四倍体，又是自交不亲... 阅读全帖 |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 45 RIP.
钱先生这一走，我最担心的是那个Prasher的饭碗了：
（Zt from WiKi）
Career[edit]
Prasher received his Ph.D. in Biochemistry from the Ohio State University in
1979. From 1979 to 1983, he worked in genetics and biochemistry research at
the University of Georgia, where he identified the gene sequence for
aequorin [1] .[4] He then joined the Biology Department of the Woods Hole
Oceanographic Institution, Woods Hole, Massachusetts where he studied
bioluminescence. In 1988, he received a two-year, $200,000 grant from the... 阅读全帖 |
|
c*********r
发帖数: 1312 | 46 类比一下，我觉得依赖database的MS在我看来和microarray差不多，还是要依赖一个
reference的。Microarray只能检测序列已知的东西，MS也只能检测在database里边有
的东西。但是这个database很全面了吗？人的和老鼠的可能不错，很多其它动物的还是
很差的吧。
另外一方面，很多蛋白和其它代谢产物不都是以cDNA为模板的，翻译后的修饰、各种酶
反应的产物，可能和cDNA没有什么关系，这时候cDNA的data base就没什么作用了。
还有一个简单的问题，希望和做MS做代谢的探讨一下。一个MS的样本的数据，有多少是
可以在数据库里找到准确的match的，有多少目前没有很好的match而无法使用，二者大
概的比例是多少？这个可以估计一下MS数据的利用率。就像RNAseq，有多少可以map到
reference。
cDNA |
|
d***n
发帖数: 12 | 47 寻找Genomics方面的专家
我们也想借未鸣空间的宝地，公开求贤，寻找Genomics方面的专家，共同创业。
专业方向:
Next Gen DNA sequencing
Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard and FLX Titanium
Solexa technology
Applied Biosystems SOLiD
Whole Genome Analysis
PCR Amplicon Sequencing
Metagenomics
Transcriptomics
Small RNA Analysis
Epigenetics
Genome sequencing and re-sequencing
ABI 3730xl, 3130xl
Amersham MegaBACE 4000 and 1000
文库构建
cDNA libraries (including standard cDNA library, large insert cDNA library,
normalized cDNA library and subtracted c |
|
d***n
发帖数: 12 | 48 寻找Genomics方面的专家
我们也想借未鸣空间的宝地，公开求贤，寻找Genomics方面的专家，共同创业。
专业方向:
Next Gen DNA sequencing
Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard and FLX Titanium
Solexa technology
Applied Biosystems SOLiD
Whole Genome Analysis
PCR Amplicon Sequencing
Metagenomics
Transcriptomics
Small RNA Analysis
Epigenetics
Genome sequencing and re-sequencing
ABI 3730xl, 3130xl
Amersham MegaBACE 4000 and 1000
文库构建
cDNA libraries (including standard cDNA library, large insert cDNA library,
normalized cDNA library and subtracted c |
|
d***n
发帖数: 12 | 49 寻找Genomics方面的专家
我们也想借未鸣空间的宝地，公开求贤，寻找Genomics方面的专家，共同创业。
专业方向:
Next Gen DNA sequencing
Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard and FLX Titanium
Solexa technology
Applied Biosystems SOLiD
Whole Genome Analysis
PCR Amplicon Sequencing
Metagenomics
Transcriptomics
Small RNA Analysis
Epigenetics
Genome sequencing and re-sequencing
ABI 3730xl, 3130xl
Amersham MegaBACE 4000 and 1000
文库构建
cDNA libraries (including standard cDNA library, large insert cDNA library,
normalized cDNA library and subtracted c |
|
l*****7
发帖数: 8463 | 50 实事求是
把我的老帖子翻出来了。
发信人: luke837 (abcdefg), 信区: Biology
标 题: Re: 既然公开说韩春雨造假，就不要再披着马甲上阵了
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jul 21 09:31:50 2016, 美东)
如果没人能重复出来，那么至少有两个层面的问题
1 韩春雨发现的NgAgo的cDNA的本质:
到底是什么?
2 韩春雨发现的NgAgo的cDNA的表达的问题
mRNA, 蛋白质
只要有cDNA就能证明清楚。
http://www.mitbbs.com/article_t1/Biology/32028273_0_5.html |
|
