z****g
发帖数: 972 | 1 要求：
1.来源于Col-0的幼苗
2.经过了nomalization,减少了abundant transcripts,比如actin, tubulin等
3.host为普通E.coli,比如W3110或DH5a
4.所在质粒需为E.coli compatible的质粒，本身带有RBS (ribosome binding site)
5.可以受IPTG诱导直接在E.coli中表达
自己google了一堆，没找到合适的。如果板上哪位知道哪里可以购买，请pm |
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m*****a
发帖数: 26 | 2 search in ABRC, possibly you can not get such a very good library since most
are just all-in-one in phage. |
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w****l
发帖数: 5 | 3 我正在寻找一对beta Actin qPCR引物， 其要求是既能用于人也能用于小鼠的genomic
DNA 或者cDNA。网络或者文献中确实有很多现成的引物，但都是种属特异性的。各位认
为是否有可能找到我所要的引物吗？ |
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W****C
发帖数: 1937 | 4
Toyota
关键的没说， 他走投无路转行前把GFP的cDNA送给了钱教授， 然后人家得了nobel |
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n***w
发帖数: 2405 | 7 哈哈，我正好要说openbiosystems,结果看到版主回了！ |
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a*****g
发帖数: 543 | 8 1） NanoString吧
2）assume mRNA-cDNA linear,用your favorite gene plasmid (算molecular weight,
molecule concentration) 做serial dilution, qRT-PCR. |
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a***e
发帖数: 1010 | 9 during RT, the template mRNA can be degraded if the reverse
transcriptase harbors RNase H activity. Thus, one mRNA molecular only
generates one cDNA.
However, an internal control is still very important to normalize the
amount of your input mRNA. Thus, including several different house
keeping genes as internal controls is still necessary. |
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e*r
发帖数: 103 | 10 ATH1 array 能否用标记的cDNA去杂？ |
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a*****n
发帖数: 2835 | 11 首先看你用的cdna来源的细胞组织有没有目的基因的表达
PCR条件可以加点DMSO，槽式PCR试试，酶可以试试clontech的advantage 2 system
mg+ |
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l******n
发帖数: 105 | 12 对，之前大家都被1993年microRNA lin-4主要抑制lin-14 RNA的翻译、而对lin-14 RNA
降解影响很小的情况误导了。
后来用cDNA microarray发现microRNA减少target RNA量的幅度非常小，就还是以为
microRNA主要是直接抑制target RNA的翻译，促进target RNA的降解是次要的。
实际上现在Bartel证明microRNA整个减少target蛋白的作用幅度就非常小（已经发表的
绝大部分direct target蛋白减少非常显著的文章，其实都是特例，因为target蛋白减
少幅度很小的情况很难发表文章），而且其中至少84％甚至90％都是促进target RNA的
降解产生的，直接抑制target RNA的翻译只占16％，甚至只占10%。
过去做microRNA抑制翻译的生化机理的实验几乎全是用串联3个，甚至7个microRNA
target的artificial 3'UTR来做，很可能根本不反映生理情况下的作用机制。
这对用RNA-Seq寻找microRNA direct target是一个福音啊。 |
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K**********e
发帖数: 188 | 13 想找个分泌mouse SCF到培养基用来做conditioned medium的细胞系，用来养某种老鼠造血干细胞。查到文献有些实验
室用，写信去要。
有个老板还是中国人呢，回信说：他记得是从ATCC买来的，建议我去买，不过如果他记错了，ATCC没的买，可以再找他
要，联系他的学生。他把信cc给了学生。
我以前就查了，ATCC之类都没有卖，所以写信给他学生要。结果他的学生回信说Unfortunately we don't have enough
cells to give you, maybe in a few month we could grow more cells and then give some away.In this case, I'll let
you know.
无语了。没听说过要花几个月才能扩增到足够细胞的，而且我要的是一个常见细胞系，类似CHO，转进去了mouse SCF
cDNA过表达而已。
这个学生这样回信是什么意思？不想给？那这个借口也太拙劣了吧。这封回信没有cc给老板，是不是这个学生怕麻烦，自作
主张不给的？他和我们又没有竞争，举手之劳，为啥不给呢？
某 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 14 就象楼上所说的，其实没必要去调。
而且这个时候测出来的cDNA浓度不准。根据这个浓度做的稀释，你以为终浓度一致，可
是最后ct值还可以差好几个cycle。
如果你一定要调整，以便获得比较一致的internal control的ct值，那就拿所有sample
出来跑一遍internal control。根据ct值决定把哪些sample作进一步稀释。 |
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j*********o
发帖数: 237 | 15 谢谢，我的siRNA是在dharmcon买的，实际上是一个pool，一共有4条siRNA，商品化的
siRNA需要测试off-target effect吗？也许可以用小鼠的cDNA去rescue。这个基因在小
鼠和人中高度同源。 |
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g*****n
发帖数: 241 | 16 请问哪个公司有卖for research use的human insulin啊？
另外有没有可能我自己买human insulin的cDNA，在mammalian cell culture表达，然
后从上清里面收集（我不需要提纯）？但是我听说用mammalian cell culture去表达
human insulin的话会因为process proinsilin效率的原因产量非常低。
谢谢！ |
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p*****r
发帖数: 64 | 17 最近正在用一个悬浮细胞做high-throughput drug screen.流程很简单,就是把细胞加
在384 plate上,加上药物,3天后收细胞,提RNA,转cDNA,再做qPCR. 但是现在发现收细胞
的时候,仪器在remove medium的时候吸走了很多的细胞,使每个孔细胞数目很不一致,这
样做出来的qPCR variation太大. 目前我用V bottom的plate养细胞,不知道大家有这方
面的经验没有,怎样才能避免第一步remove medium时尽量不影响细胞的数目? 有没有可
能不remove medium,就直接在培养基里直接加lysis buffer,拿到RNA呢? 多谢了 :) |
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p*****r
发帖数: 64 | 18 多谢大家的建议.
aishang,我目前就想用机器先remove大部分的medium,剩下约8ul的medium (如果剩下的
medium太少的话,机器的tip头就会很容易带走细胞),然后多加一些lysis buffer.虽然
这样lysis buffer被稀释了,但可以试试能不能拿到足够的RNA.
ArtyArty: 我目前用的是Cell to CT kit, 它提供lysis buffer, stop buffer,裂解细
胞后,可以拿到RNA, 然后RT 后拿到cDNA.你能不能告诉我你知道的那个不用提RNA,就可
以做qPCR 的kit吗?十分感谢
smartkevin: 多谢你帮我查的plate, 我先打电话问问corning,看他们的这个plate怎么
work的,希望fit my story
目前这个实验是在broad做的,但broad里的人都用贴壁细胞,这样remove medium的时候,
细胞都不会少,所以他们对我的悬浮细胞也没什么好的建议.
多谢各位了. |
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P******m
发帖数: 21 | 19 标准品是DNA，melting curve很正常，样品是RNA用random primer 做RT 来的cDNA，
melting curve有个小峰在主峰前面。样品RNA相对单一，没有non-target RNA 干扰。
貌似不是PCR的问题，是不是RT的问题，random primer做RT 造成的背景？qRT—PCR我
是新手，请人指点一下。 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 20 那如果只是做用cDNA做半定量的PCR，然后跑胶看基因表达还是不表达，最多粗略估计
一下表达量高还是低，能把两对引物放一起吗？ |
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m*********7
发帖数: 606 | 21 不客气，希望你能顺利克隆。
还有一个办法你可以试一下，如果你这个蛋白序列比较保守的话，你可以将已知的序列
，如sequence1,去和其他物种（如小鼠，大鼠，黑猩猩）的genome sequence及已知的
cDNA序列比较一下。高度保守的蛋白在较近的物种间coding sequence的exon和intron
间splice的方式很接近，有助于你判断start codon和stop codon的位置。反正你只需
要知道coding region和很小一部分的5'-UTR和3'-UTR的序列，方便克隆就行。 |
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y******e
发帖数: 277 | 22 谢谢楼上两位大侠！ =）
不好意思，顶楼没有说清楚 >_<
是有2G多的reads，75bp each。没有参考的genes，不过是和果蝇相近的
fly。之前手动检查了一些同源基因，和果蝇的蛋白序列基本一样，cDNA有很多
synonymous substitutions。
我的想法是，先把所有的reads当成新的序列做assembly，之后再用blast against果蝇的基因做annotation。因为不太清楚直接用75bp RNA-seq reads match果蝇的transcripts 成不。。。
没有经验，多谢大家帮忙啦！ |
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X***n
发帖数: 366 | 24 cDNA当然是混合物，同一基因还有不同splicing形式呢。所以应该跑gel, cut the gel
then cloning and sequencing. |
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i****o
发帖数: 40 | 25 考虑到是cDNA 又是cancer cells 这有可能是RNA editing的结果 可以看一下是否A/G
change较多 |
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z**********8
发帖数: 766 | 26 Hi iFanso,
Thank you very much for your kind reply!
I was told by another people who has same idea with you. I checked the
mutation sites and found only a few harboring A to G mutations. I will
repeat several samples and cell lines again, and do two RT reactions for
getting cDNA, then see what will happen.
Really appreciate your kind information!
Thanks a lot!
G |
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d**********t
发帖数: 20415 | 27 最近realtime PCR遇到怪事了，请大家帮忙分析下原因：
问题：几个基因的值出现很多undetermined的结果，但是之前一直在同一个cell line
里做，一直都可以检测到
条件：Realtime的template是RNA反转录的cDNA
cell line和RNA抽提的方法都和以前一样，处理方法也一致
引物用的是刚刚从stock里面稀释出来的，和之前的实验来自同一管stock
拿之前证明可以检测到的RNA作为阳性对照，也是undetermined
反转录kit整个实验室公用，其他人没有遇到问题
反转录试过oligo dT和random primer，结果没有差别
其中一个基因刚刚设计了一对新引物结果也是undetermined
作为positive control的基因可以检测到没有问题
多谢了
如果需要更多细节，我会补充 |
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h****k
发帖数: 182 | 28 从cDNA中pcr克隆基因，如果5'端翻译的起始密码子有多个可能，如何设计引物或者有
什么好方法可以解决这个问题？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 29 我是从commerical plasmid里面克隆cDNA，所以这个引物上面没有酶切位点。。。按照
IDT的Tm计算是50多，但是如果按finnzyme的算就过60了。。。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 30 嗯，它配好的里面Mg终浓度是2mM，但是mannual说要p cDNA的话，最好是用3mM的Mg，
于是我又加了一点，work了一次。。但是再后来我就重复不出来。。。
我的目的片段是2.3kb，我的reaction conditions是：
95度 4min
93度 1min
50度 1min
72度 1min
72度10min
4度 forever
跑30个循环。。。 |
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g******1
发帖数: 244 | 31 在新实验室第一次做RT-PCR，用的是实验室传下来的protocol。
oligoT作RT以后再用cDNA扩增，使用200bp左右产物的primer sets扩增，3组全部扩出
产物；但是
同一个基因，1kb左右产物的primer set就扩不出来。因为有正负对照，知道PCR体系和
引物没问题。
但是试了很多次，包括使用其他基因的引物，都是括不出大片段。
这是什么情况？ |
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p******i
发帖数: 1092 | 32 大家觉得瓶颈是哪一步？ 是前面的ReverseTranscription吗？
谁能说说有什么要点需要注意，或那个好KIT推荐一下……
多谢各位了～ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 33 自己动手做是什么意思？
另外要看你下一步是要做什么的
做RT-PCR呢
还是做primer extension呢
还是做libary呢。。。。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 34 我现在在台湾，这里貌似没有addgene的代理……不知道海关如何……因为是邮寄细菌
的管子……
现在还在找其他家有没有卖…… |
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C*******e
发帖数: 4348 | 35 你要的基因有多长？
一个是前面RNA提得要好
做后面的实验的时候如果有可能就加些RNaseIn之类的RNase inhibitor
Ambion,Promega之类的公司都有的
另外就是反转录酶要好
像ls有人说的invitrogen的
还有我用过USB的M-MLV的也不错 |
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z****g
发帖数: 3340 | 37 以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好. |
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s******r
发帖数: 2876 | 38 那你可以先用普通的细胞，比如293，来试试你的病毒，
不用加drug，感染后，western先看看。
以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好. |
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f*******e
发帖数: 354 | 40 只是提到快和fidelity啊，不知道是不是同样可以理解为效率高 比如极少量的模板也能
高效扩增 |
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c**********6
发帖数: 1173 | 42 Herculase 和phusion比怎么样？
我做的Herculase的产量是最高的。当然啦，我的PCR的底物浓度很高的那种。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 43 我google了一下，貌似有它線粒體的genome...
我現在要pcr一個基因的cDNA，但是它有3個isoforms，如果設計primer針對coding
sequence，3個都有可能被P出來……
而，實踐證明：P出來的是不想要的那個……
我想是不是可以先對UTR做PCR，然後再P coding sequence...
其中的一個isoform有5UTR 和3UTR，但是不知道其他的2個有沒有…… |
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p******i
发帖数: 1092 | 45 我把TLR4 cDNA (2.6kb)从macrophage里PCR出来，加上XhoI和BamHI，接到
pEGFP-N1里，测序结果也是正确的，就是TLR4后面接了个in frame fusion的EGFP
但问题是transfect到293T里不亮，而空载体pEGFP-N1很亮……
我现在怀疑是kozak不够强，准备在ATG前面加一个
GCCACCATGGXX，不知道会不会有帮助……
哪位做过类似的实验，请不吝赐教啊，
在下先谢过了…… |
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m***c
发帖数: 637 | 46 i did a 3kb cdna-GFP fusion protein, signal is very weak, it may hide the
green color |
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Z******5
发帖数: 435 | 47 比如说我要检测没有处理的细胞Con和处理后的细胞Tre之间基因G表达的变化，那么就
是要分别定量Con和Tre cDNA中基因G和内参GAPDH的量。 要看基因G的变化，就是看它
在实验组和对照组中相对于内参的变化。 这个应该算是同一个模板里不同基因的相对
定量吧。 |
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y***k
发帖数: 60 | 48 理论上确实1更好一点，可以减少不同管中cDNA量差异带来的误差
不过碰到大量sample的情况还是2更方便啊......并且我不觉得2会比1差很多......
，
， |
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f*********r
发帖数: 1233 | 49 大家都过虑了。
模板（样品、cDNA）加得一致不一致，其实没那么重要。精益求精当然好，但RT-PCR是
个非常敏感的实验，duplicates或triplicates之间Ct值互相吻合的程度很低（相对于
其他定量试验而言，比如ELISA）。一般情况下，duplicates的Ct值相差0.5就可以容忍
（有的实验室可能要求0.2，我在此致用0.5来举例）。那么这个0.5是个什么概念呢？
那就是2^0.5，或者说根号2，也就是1.4。这两个duplicates，其中一个比另一个高40%
，这样都可以容忍。
你加模板的时候，假设加5ul。140%就相当于7ul。你想想看，谁加样的技术能差到这个
地步？所以说，模板加得是不是一致，并不重要。Ct值的偏差来自于其他试验条件。
那么引物啊、buffer啊、原料啊（dNTP）、酶啊等等的重要程度如何呢？我不想展开太
多。简便起见，我只说说引物和master mix（就是buffer，原料、酶、荧光染料的混合
物）。在对数扩增曲线（LOG VIEW）中，模板的多少主要影响x轴截距；引物的多少主
要影响平台的高度；master mix的特性主要影响斜率（... 阅读全帖 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 50 讨论总是有益的。自己算，即使能得出准确数值，但是得不出集体讨论所覆盖的广泛外
延。
做RT-PCR，不用过分追求百分之几、十几、甚至几十的误差。因为cDNA存在百分之几百
、几千的差别（也就是数量级上有差别），才会有蛋白水平上detectable的差别，才会
有意义。
Ct |
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