d****d
发帖数: 214 | 1 I have not used lentiviral vector before, so I cannot comment on that. But
as I said, I can get over 90% transduction efficiency using the pMSCV vector
to express just one cDNA. When I use 2A strategy to express two or three
cDNAs, then I can get 50% transduction efficiency, which should be
acceptable for many applications. |
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C********4
发帖数: 308 | 2 @新药研发观察
史上最苦B 的生物学家：Douglas Prasher 号称最先发现绿色荧光蛋白(GFP)，但是不
但没有得到诺贝尔奖，反而经历多次换实验室和下岗，最终离开科学领域，成了汽车司
机。最新进展：在61岁又回实验室做实验了。 http://t.cn/zYl8TMG 这是作为好消息来报导的，请勿做为反面宣传材料。
不知道钱永健给他什么title？ 61岁的老博后？？
What Ever Happened to Douglas Prasher?
The first researcher to clone the gene for green fluorescent protein, but
who was passed over for the 2008 Nobel Prize in Chemistry, is back in
academic science.
By Bob Grant | February 26, 2013
3 Comments
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w********r
发帖数: 1431 | 3 你这个情况我觉得很难讲。
我以前做siRNA resistant的cDNA mutant，是根据SiRNA的序列，对应的每个codon都做
silent mutation，绝大部分都work。直到有一次，虽然突变了，但是仍然可以被siRNA
干掉。
后来我做rescue就设计target 3'UTR的siRNA,然后直接用wt cDNA做rescue就可以了。 |
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u**q
发帖数: 4 | 4 刚到新实验室，第一天讨论，老板提出要制备200个样品的small RNA cDNA libraries
for deep seq. 我有提RNA的经验，也制备过libraries.但是都是小规模的。 老板问我
需要多长时间从临床样品到cDNA libraries，我当时觉得这个是个大工程，说至少半年
吧，当然我们可以给每个样品barcode。这样只需要制备几个libraries，至少不需要测
200次，省钱，省时。不过也是个不小的工程，老板期望期望远远要少于半年，老板说
两个月就应该做完，求解这样的老板是太push太不切实际，还是我本人不work hard呢
？ 谢谢了，欢迎大家讨论。本人以前在一个实验室完全靠自觉，还不太习惯被push.
希望多了解一下大家的想法 |
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m***o
发帖数: 272 | 5 I am using sybr green qPCR,当测试primer时，用1,1:10,1:100,1:1000,1:10000
cDNA dilution.经常会出现这种情况:用所有5个浓度，primer efficiency会140%，如
果用最稀释的3个，efficiency会好些105%。查查是PCR inhibitor的问题。
如果这样的话，这个primer还是可以用的。
我的问题是：是不是应该把cDNA 也要稀释至少100倍才可以得到可信的结果呢？
谢谢！ |
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s******9
发帖数: 283 | 6 When you deal with less than 100 copies, you need to consider RT-PCR as a
series of random processes (e.g., Poisson): 1) template destruction, which
is significant for RNA templates, 2) distribution of successful cDNA
synthesis, and 3) distribution of successful cDNA amplification in each
cycle. Many stochastic variations can affect a final output. |
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n********e
发帖数: 1630 | 7 你做qPCR 要不要把RNA 反转录到cDNA。 你用什么RT？ 可能RT效率很低，RNA浓度低了
就无法产生cDNA。 |
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v********9
发帖数: 129 | 8 代朋友发帖，全文如下：
我叫陈熹，是张辰宇的学生。昨天有朋友告诉我，说你老板火了，在MITBBS被人“打脸
”了，让我去看一下。我心想，又是NBT这事，挺无语的，不过去看看国外的中国留学
生怎么看这个事情也好。看完我就郁闷了，我们课题组的文章怎么就是“垃圾”了，张
辰宇怎么就是“joker”了？其实以往对于这些事情我都是缄默的，搞科研的数据说话
，所以一直以来也在坚持做着这个领域，希望做出更多的东西来，弄明白一些问题，但
是心血被贬得一文不值，不吐不快。你说外洗地也好，说我是打手也好，我无所谓，我
就是想说说心里真实的想法。
1. 首先，我想澄清，我们的工作不是“垃圾”，张辰宇也不是“joker”。我们实验室
从2004年开始做miRNA，当时规模很小，就我一个人做，平台也刚开始建立，进展较慢
。但经过三年时间，miRNA的检测技术和功能研究我们基本都能做了，一个机缘巧合，
我们发现血清中普遍含有miRNA，从此我们从细胞内miRNA跳到了细胞外miRNA，并确立
了以研究细胞外miRNA为实验室的主要方向，期间的主要发现是：发现血清中有循环
miRNA；发现经由microvesicl... 阅读全帖 |
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B*D
发帖数: 5016 | 9 从北朝转的
http://www.cctvdream.com.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=51
ge%3D1
注：由于之前实验室有同事认为本文对之前实验室的研究细节有泄密嫌疑，因此文章做
了删节处理。当然，公开发表的文献懂行的读者能猜出这些此处已删除的背面都是什么
，就请大家给个面子，不要人肉了。前面一段主要是让大家直观了解一下现代尖端生物
研究中上下游的长度，QA，QC的复杂性和研发技术平台的长期性。花十年，2-3代博士生
打造世界一流技术平台的艰辛，真的很不容易。这也从一个侧面阐述了“引进即落后，
追也追不上”的怪圈的产生原因，并通过一个例子来讲述怎样打破怪圈，建立世界一流
技术平台。
小议生物学研究中的技术平台的作用
上个月，我以前的实验室（后文为了描述方便，称为北大实验室）发表了一篇Cell的封
面文章，这是一个非常难得的成果。关系挺铁的哥们发了好文章，让人激动不已。关于
这篇文章的科学意义，Cell有专文评述，网上也有很多文章讨论，这里就不多谈了。笔
者特别欣慰的是，这篇文章标志着北大实验室相关技术平台达到世界一流水平。这个技
术平... 阅读全帖 |
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n********e
发帖数: 1630 | 10 这个问题我遇到过。RNA 到cDNA， 不同的RNA 的浓度影响RT的效率，你可以做个
standard curve， 用一系列浓度，包括你估计的RNA 药品的浓度（通过preliminary的
RT pcr测） 如果你的样品差别不大，就没问题，如果你的样品浓度差别很大。有可能
浓度很低的样品，RT 效率也低。我遇到过。我的经验是 10^9 以上的copy number，
基本可以达到1 RNA 得到 1 cDNA， 但是这个浓度做qPCR 太高。如果是 10^2 - 10^7
copy RNA 做RT，效率会很低，我最好的结果是10%。这个10%是在这个范围内一致的。
所以也没问题。你用的是什么RTase， Superscript III 好一点，另外加点RNAase
inhibitor.
我曾经为这个RT step折腾了很久。。。后来知道，很多人都不这么做，直接拿内参。
。但是确实RT effeiciency在不同浓度是不一样的 |
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m***o
发帖数: 272 | 11 跟帖问个基础问题，大家不要见笑。
RNA 做RT 的时候，一个mRNA分子就逆转出一个cDNA吗？还是逆转录酶可以无限的
bindingRNA，得到很多cDNA? |
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h*********g
发帖数: 18 | 12 I will design primers for qPCR.
First, I will find the cDNA for the gene from ensemble website. Then put the
cDNA sequence into Primer3 website.
For the parameters, I set as following
Primer size Min 20, Opt 22, Max 27,
Primer Tm, Min 57, Opt 60, Max 63.
GC% Min47, Opt 50, Max 65
It that all I need to consider? Is there anything else I need to pay
attention?
If anyone knows any good websites teaching how to design primers, please let
me know.
Thank you very much. |
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w*e
发帖数: 740 | 13 请教一个这个方面的高手们，我想做一个过表达一个non coding RNA 的vector，我是
用只用cDNA序列呢，还是用整个genome里面的序列。以前都是做coding gene 的过表达
，只要cDNA就够了，不知道non coding RNA有没有什么特别要注意的？
谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 Taqman 因为信号取决于probe, 所以对杂带的容忍程度高一些，所以Ct可以做到稍微高
一点点（也就一点点而已）。你的这个问题其实主要是因为不同公司作的buffer的优化
程度不一样。
如果你用同一个buffer，primer, 以及同一个酶来跑，你就会发现其实这两者相差真的
没那么大。
对于SYBR,一般说可以做到是30, 但是出于谨慎，凡是超过25的我都会直接扔掉然后重
新配更
浓的样品从新作。另外，一般地方会让你加个1ul cDNA sample,我是宁可把cDNA
sample 稀释了然后直接加个3ul（因为这样上样的误差小很多）。
你的情况，我的建议是不要浪费时间搞什么优化，直接用Taqman吧。
如果你真的有特殊原因要用SYBR，那么建议你直接搬用Taqman buffer（不加probe即可
），然后自己手工加SYBR-green and DMSO, 而不是从头优化Invitrogen buffer.
Ct |
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A******y
发帖数: 2041 | 15 Are you telling me that you did not validate your primer amplification
efficiency? You input cDNA is total cDNA, you don't need to adjust every
time, but you do need to check your primer linearity and amplification
efficiency. If you didn't, please tell that to the reviewers, lol. Btw, I
have seen primers that are good in taqman that are completely useless in
SYBR rxn.
Btw, show me you actually validate your amplification efficiency and
linearity before we keep talking.
low
still |
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x********e
发帖数: 35261 | 16 问题是method里说RT用的是随机引物或者oligo dT,这能转录出环状cDNA? 用环状cDNA
做qPCR我能理解。
either |
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x********e
发帖数: 35261 | 17 RT-PCR我还是做的，我就是知道RT产物是linear DNA才觉得sunnyday说RT可以产生环状
cDNA有问题。之所以问这个实验细节是因为RT-PCR那个实验画的示意图是环状cDNA。
splicing |
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n********b
发帖数: 27 | 18 There is a position opening for a Principal Lab Assistant in a new Genomics
Center of a University located in southern California. The position is
supported by hard money with good benefit plans. Please send your resume
and email to [email protected]
/* */, if you are interested. Thanks!
------------
Principal Lab Assistant
Center for Genomics
Job descriptions:
1. Performs bench work related to research projects using different genomic
technologies including next-generation sequencing (N... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 17729 | 19 ............
cDNA克隆是克隆的入门级别吧。map亚克隆，大片段的装载才是关键。天天用kit的小白
，抽个能用的BAC质粒就能搞哭你说的那种cDNA克隆。 |
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r**********e
发帖数: 587 | 21 用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
如果是的话，我能想到的可能性时有：
1.region1除了pre－mRNA之外还存在着其他的RNA比如lncRNA
2.region1在被splice形成RNA lariat之... 阅读全帖 |
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m********a
发帖数: 239 | 22 I am thinking about creating a virus that overexpresses a receptor
protein in rodents. Should I use rodent cDNA or human cDNA? Which one is
preferred? |
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K****n
发帖数: 5970 | 23 这样是提cDNA么？岂不是缺失了很多intron的信息 |
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o******e
发帖数: 575 | 24 《也谈方舟子“最聪明”“非常适合作科研”》
方舟子的今天的一番自我煽情，真是说可以笑死人。全文付在下面，这里
先引一段：
》我的导师认为我是他见过的最聪明的学生，非常适
》合做科学研究工作，在我申请博士后、研究基金时，
》都给予最强烈的推荐。
英文俗话说，ＹＯＵ ＣＡＮ ＴＡＬＫ ＴＨＥ ＴＡＬＫ，ＣＡＮ
ＹＯＵ ＷＡＬＫ ＴＨＥ ＷＡＬＫ？再简单明了点，就是ＳＨＯＷ
ＭＥ ＴＨＥ ＭＯＮＥＹ。方的导师居然如此高评方舟子，那么我们
不妨先来看看方舟子在读博士期间发表了什么文章：
RNA Polymerase II-associated Protein (RAP) 74 Binds
Tran????ion Factor (TF) IIB and Blocks TFIIB-RAP30 Binding.
S.M. Fang and Z.F. Burton
The Journal of Biological Chemistry, 270, 11703-11709 (1996).
A cDNA encoding RAP74, a General Initiation Factor for
Tra... 阅读全帖 |
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m**c
发帖数: 7299 | 25 英文没听说过，中文肯定也不懂。简单介绍一下，不同细胞表达不同的基因，其中很多
是通用的，大家熟知的，也是广泛研究的，（对于研究者是没用的）要找新基因就要先
排除这些已知的背景，于是就有了difference display 差异显示分析方法，简单说一
个RNA如果在一个组织中出现而在另外的组织中不出现，它很可能就是一个决定功能的
基因，研究方法就是设法去掉公共的部分，而从特异的部分寻找新的基因。
找篇科普读物吧。
一种新的基因克隆方法——消减杂交差异显示分析方法
摘 要：消减杂交差异显示分析方法（subtractive hybridization difference
display，SHDD）是近年来在cD—NA代表性差异分析方法（cDNA Representational
Difference Analysis，cDNARDA）和mRNA差异显示分析方法（mRNA Differential
Display，mRNADD）的基础上发展而来的一种克隆基因的新方法。SHDD方法结合了
cDNARDA的特异性特点与mRNADD在双向筛查差异片段和较高的检测灵敏度方面的优势。
在具体技术路线... 阅读全帖 |
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X****i
发帖数: 1877 | 26 【 以下文字转载自 Stock 讨论区 】
发信人: XiuShi (致力为花街散财，造福散户), 信区: Stock
标 题: 【2018年12月31日的熊牛大会战：888个股的短期谷底高峰预测】
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Nov 28 09:59:53 2018, 美东)
【2018年12月31日的熊牛大会战：888个股票的短期谷底和高峰的预测】
此役由早已充分准备好的花街熊军诱惑散户牛军入牛套后突袭而爆发。
会战规模之大，战况之惨烈，尤其选择于2018年最后一天，影响深远。
大会战虽才刚刚开始，但可预见将以散户牛军被全歼，血流成河结束。
熊市策略是逢高峰就卖空，谷底补空平仓，如此周而复始。要少做多。
熊市性质是多数日子前盘价位高，后盘价位低，如此制造下跌的趋势。
对比预测，如果股价越极端，散户获暴利的机会和风险其实反而越佳。
花街的捣蛋，挤空或砸价，其实是制造极端价供精明的散户收割暴利。
花街这么做绝非善意，而是要吓唬散户在其人为的极端价割肉出局。
花街有用之不尽的代理基金和资金充炮灰，可以任性的挤高峰砸谷底。
花街有别人的代理钱来任性，用大量炮灰钱可以买出涨价，... 阅读全帖 |
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X****i
发帖数: 1877 | 27 【 以下文字转载自 Stock 讨论区 】
发信人: XiuShi (致力为花街散财，造福散户), 信区: Stock
标 题: 【2019年1月9日的 1,200 个股票的短期谷底和高峰的预测】
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 9 19:01:30 2019, 美东)
【2019年1月9日的 1,200 个股票的短期谷底和高峰的预测】
熊市策略是逢高峰就卖空，谷底补空平仓，如此周而复始。要少做多。
熊市性质是多数日子前盘价位高，后盘价位低，如此制造下跌的趋势。
对比预测，如果股价越极端，散户获暴利的机会和风险其实反而越佳。
花街的捣蛋，挤空或砸价，其实是制造极端价供精明的散户收割暴利。
花街这么做绝非善意，而是要吓唬散户在其人为的极端价割肉出局。
花街有用之不尽的代理基金和资金充炮灰，可以任性的挤高峰砸谷底。
花街有别人的代理钱来任性，用大量炮灰钱可以买出涨价，砸出跌价。
股票最不定因素，就是花街每天对散户的捣蛋，尤其挤高峰和砸谷底。
以下是为蝌蚪们提供的最基本，炒股绝对须要遵守，的注意事项：
1. 预备大量(>=50%)现金，准备用来收割花街人为制造的捣蛋极端价... 阅读全帖 |
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X****i
发帖数: 1877 | 28 【 以下文字转载自 Stock 讨论区 】
发信人: XiuShi (致力为花街散财，造福散户), 信区: Stock
标 题: 【2019年1月11日 888 个股票的短期谷底高峰预测】
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jan 11 09:45:27 2019, 美东)
【2019年1月11日 888 个股票的短期谷底高峰预测】
【2019年1月11日的 888 个股票的短期谷底和高峰的预测】
熊市策略是逢高峰就卖空，谷底补空平仓，如此周而复始。要少做多。
熊市性质是多数日子前盘价位高，后盘价位低，如此制造下跌的趋势。
对比预测，如果股价越极端，散户获暴利的机会和风险其实反而越佳。
花街的捣蛋，挤空或砸价，其实是制造极端价供精明的散户收割暴利。
花街这么做绝非善意，而是要吓唬散户在其人为的极端价割肉出局。
花街有用之不尽的代理基金和资金充炮灰，可以任性的挤高峰砸谷底。
花街有别人的代理钱来任性，用大量炮灰钱可以买出涨价，砸出跌价。
股票最不定因素，就是花街每天对散户的捣蛋，尤其挤高峰和砸谷底。
以下是为蝌蚪们提供的最基本，炒股绝对须要遵守，的注意事项：
1. 预备大量(>=... 阅读全帖 |
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X****i
发帖数: 1877 | 45 【 以下文字转载自 Stock 讨论区 】
发信人: XiuShi (致力为花街散财，造福散户), 信区: Stock
标 题: 【2019年10月14日，499个米股短期谷底高峰预测】
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Oct 15 09:32:17 2019, 美东)
【2019年10月14日，499个米股短期谷底高峰预测】【以卖空为主】
【2019年10月，炒米股的佣金可以完全免费，散户的黄金时代开始】
http://www.mitbbs.com/article_t/Stock/37719717.html
【这里的信息仅供海内外华人间的共享，严禁翻译，严禁违规散布】
【金融手段超级犀利高效之处，正是不动一兵一卒立即能达到目的】
【米国熊市跌1/2是少，跌2/3正常，逢高峰价卖空，可迅速致暴富】
【散户，企业，机构把钱上缴花街供其"全权代理"，无异割肉喂虎】
【散户在自然谷底买进，花街就来砸价，高峰卖空，花街就来挤空】
【股价起跌90%是花街特意与散户捣蛋的结果，事后用新闻做掩护】
【散户熟悉花街的诡计和伎俩后，能每天轻松收割其捣蛋的极端价】
【这里的信息是对准花街的照妖镜... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 46 麻痹 赶紧向国际社会求援 把rna或者cdna寄到美国来
十个字十个字十二个 |
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a***k
发帖数: 1038 | 47 没有。我是外行，知道里面有啥门道吗？正链rna病毒的cDNA要做转换吗？
: 这个序列在SARI中能找到吗？
:
TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCC
:
GCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGT
:
GGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGAC
: -3
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C**o
发帖数: 10373 | 48 楼上都是千老么？
盹盹盹
：没有。我是外行，知道里面有啥门道吗？正链rna病毒的cDNA要做转换吗？
：【 在 lubbock12(非老非小将) 的大作中提到: 】
：<br>: 这个序列在SARI中能找到吗？
：<br>:
：
TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCC
<br>:
：
GCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGT
<br>:
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GGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGAC
<br>: -3
：<br> |
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A****7
发帖数: 902 | 49 https://www.med.unc.edu/microimm/directory/ralph-baric-phd-1/
Ralph Baric, PhD
Professor
Department of Epidemiology
3304 MHRC, School of Public Health
919-966-3895
Research
Most of the research in our laboratory has used coronaviruses as models to
study the genetics of RNA virus transcription, replication, persistence, and
cross species transmission. We have also been using alphavirus vaccine
vectors to develop novel candidate vaccines against caliciviruses. Specific
areas of interest include:
1... 阅读全帖 |
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f**********n
发帖数: 29853 | 50 咱别聊这些了，没劲。
我问你，最后是cDNA还是RNA？ |
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