c******r
发帖数: 3778 | 1 明显4度的和室温的发生了降解。细条带是降解产物。应该还有条相应的小分子条带，
可能EB跑出去了，所以看不清楚了。maxi没做干净，还有enzyme的contamination，所
以这个降解是比较特意性的，而不是smear。
室温的降解更明显，full length的已经全部降解，但是那个细条带由于继续水解的速
度远不如从full length降解的速度，所以还比较明显。但是多放几天，这个条带也会
消失。
艳阳天说了，要加EDTA才能防止水解，但是有时候EDTA会影响下面的反应，最好还是-
20度或者-80度保存比较安全方便。
没有切过。最左边的是ladder，然后从左到右依次是冻在-20度的，藏在4度的和丢在室
温的。过了五天拿出来电泳，看看降解得怎么样了。如大家所见，最左边的条带（-20
度）看上去挺好，超螺旋和开环的分明。但是中间和右边的已经降解了，在超螺旋条带
下面又多出一条细细的但是明显的小条带。请问谁知道这个小条带是怎么回事呢？ |
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e***o
发帖数: 344 | 2 最近跑DNA胶很邪门，首先是基因组DNA的条带大小在不同的胶里跑得不一样。做3C-
library，所以在提取的过程中没有除去蛋白质，用裂解液裂解细胞后，离心收集细胞
核，再分别用SDS和Triton X-100裂解细胞核后跑的琼脂糖胶。
其中2，3泳道是刚提取完时跑的电泳条带，1，4孔道是将同样的样品放置6个小时左右
后跑的电泳条带，结果条带大小就发生了改变，有15000bp左右减小到了几百bp，而且
每次跑胶，电泳条带的大小都不固定，大多都只有几百bp，和基因组大小不符！
然后是回收cDNA500-700bp的带加adapter,扩PCR也出现这种飘移现象。到别的lab也试
了，还是这样。跑别的特异PCR扩增和酶切质粒都是好好地。真是邪门了。
请大家分析下是什么原因造成的。谢谢！ |
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m****m
发帖数: 395 | 3 最近提纯一个HIS-TAG的蛋白，试了很久就是不是一条带，一直以为是杂带没有清除，
后来感觉不对劲，好像就是它本身。但是很奇怪，如果是这个蛋白的二聚体、三聚体等
，应该是跑在整数倍的线上啊，但是不是，可这些条带又是线性有规则地排开的。还有
，有时候同一条带上的一条蛋白会分裂，就是靠得非常近，但是仔细看是分裂的。有谁
能帮我解释一下为什么会跑出这种胶的结果来吗？同一个蛋白构象不同，条带也会不在
一个地方吗？ |
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m***o
发帖数: 272 | 4 刚开始去一个lab，做PCR，最近发现阴性对照组经常有跟目的片段一样大小的条带。用
过不同primer，那个片段就跟我的目的片段一样变。如果是水污染了，但是有些管PCR
就什么都没有。因为做的是5和3’RACE，有时候第一次PCR阴性对照组很干净，在用这
个做nest PCR就有了。感觉如果cycle多用的话，阴性对照组就会出来条带。老板今天
专门强调这是技术问题，还是绝对的技术问题。郁闷的不行，唉，刚开始来这个lab，
感觉这个实验室挺脏，是不是环境不好，但是有些组就什么条带没有。但是阴性对照是
经常有，而且条带亮的快赶上阳性对照了。各位，可能是什么问题呢？谢谢任何建议！ |
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t*****z
发帖数: 1598 | 5 图在这里，看不到的点击链接啊：
[img]http://www2.picturepush.com/photo/a/6117040/img/6117040.jpg[/img]
我在琢磨大质粒的降解和构象变化的问题。这是一个大约17kb的质粒，大抽出来的，没有切过。最左边的是ladder，然后从左到右依次是冻在-20度的，藏在4度的和丢在室温的。过了五天拿出来电泳，看看降解得怎么样了。如大家所见，最左边的条带（-20度）看上去挺好，超螺旋和开环的分明。但是中间和右边的已经降解了，在超螺旋条带下面又多出一条细细的但是明显的小条带。请问谁知道这个小条带是怎么回事呢？
多谢啦！ |
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g*****n
发帖数: 241 | 6 我FLAG IP了一个蛋白，然后跑western，用anti FLAG得到blot之后strip membrane，
然后用抗蛋白本身的抗体再probe一遍，结果发现两次得到的条带不重叠 （相差不远，
但很明显不重叠）。FLAG抗体出现两条带，高的带明显，低的带比较浅。但抗蛋白本身
的抗体得到一条带，和低的那条带差不多重叠。
本来是想用两个抗体各检测一遍更严谨点，没想到出了这样的结果反而麻烦了。请问大
家这是怎么回事。
谢谢 |
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C*******4
发帖数: 400 | 7 首先排除抗体本身的中轻链（～50和25kD), 其次Flag在～35kDa左右能拉和反应对一条
非特异带。很常见。要甄别一下。
[在 geosmin (Little+Monkey) 的大作中提到：]
：我FLAG IP了一个蛋白，然后跑western，用anti FLAG得到blot之后strip membrane，
：然后用抗蛋白本身的抗体再probe一遍，结果发现两次得到的条带不重叠 （相差不远
，但很明显不重叠）。FLAG抗体出现两条带，高的带明显，低的带比较浅。但抗蛋白本
身的抗体得到一条带，和低的那条带差不多重叠。
：........... |
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C*******4
发帖数: 400 | 8 可能这个蛋白不稳定，一部分有降解，但FLAG还都在。抗其自己的抗体因为要检测的那
一段缺失了，就不能检测到。试一试抗另一边的抗体。如原来的是抗N端序列，换一个C
端的试一试。
[在 geosmin (Little+Monkey) 的大作中提到：]
：我FLAG IP了一个蛋白，然后跑western，用anti FLAG得到blot之后strip membrane，
：然后用抗蛋白本身的抗体再probe一遍，结果发现两次得到的条带不重叠 （相差不远
，但很明显不重叠）。FLAG抗体出现两条带，高的带明显，低的带比较浅。但抗蛋白本
身的抗体得到一条带，和低的那条带差不多重叠。
：........... |
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v***a
发帖数: 1242 | 9 要克隆一个gene，发现用我自己培养的细胞来PCR扩增时，大部分P不出，少数P得出。
用别人养的相同的细胞，都P不出。凡是P出来的，会有两条靠得很近很近的条带（~1.
5kb）。
然后我就挖了上面的那一条下来，做成plasmid了，测序也都完全正确。
这次要做recombinant protein，所以重新设计了primer（PCR产物很短，只有600多bp
），用上次做的现成的plasmid进行PCR，结果又P出来两条很近的条带。
有点想不通，请教一下大家这是怎么回事呢？
另，做western blot时偶尔也出现靠得很近的条带（忽而又只有一条），没有见过有相
关isoform的报导。
谢谢！ |
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G***G
发帖数: 16778 | 10 邻居割完草，会有条带纹。但是我的不是很明显。
请问大家有经验的，如何弄出深浅不一的条带纹？
需要在割草机上设置什么吗？ |
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m****m
发帖数: 395 | 11 要提纯蛋白，可以看到提纯前虽然有些杂带，但是目标蛋白还是一条带在那里的，于是
我用NI柱提纯，其中用0.1%SDS洗柱子去杂蛋白，最后用1%SDS洗脱蛋白，洗柱IMIDAZO
浓度36mM,洗脱IMIDAZO浓度500mM，取样都用BME切了（5%BME，冷室overnight），结果
用纯化前蛋白、洗柱取样、纯化后的蛋白跑胶完后发现，纯化前的目标蛋白还是一条带
（有杂质），但是经过SDS洗和洗脱后的样品都发现我要的蛋白居然分裂成两条临近的
带，距离有5KD左右，都挺深的（一条稍微浅点），太奇怪了，想不通！ |
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m****m
发帖数: 395 | 12 有没有有经验的啊？
1ul的样品，加1*SB至20ul后全部加入胶孔，最后条带亮度中等，也就是，
marker上了3ul，比marker的那个条带要亮1倍左右。
估计我这1ul的样品里有多少ug蛋白呢？
样品总共700ul，我想知道这700ul里有多少mg的蛋白。 |
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R*****w
发帖数: 447 | 13 需要你自己设计序列，让公司合成的。这段tail序列可以是任意序列，但你需要先
blast一下，不要找个与human或mouse的genome相似性很高的，否则你会有麻烦。
理论上会有很多条带，甚至smear，但实际上只会有1－3条带，你可以只挑最大的那条
带做克隆测序就可以了。
good luck |
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c***y
发帖数: 615 | 14 单引物产物应该不能形成DNA双螺旋的，怎么可能在EB胶上检测到闪亮的条带？原模板
是cDNA pool,扩增之前检测不到这条带，几乎就是均匀分布的smear。 |
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g******u
发帖数: 66 | 15 western blot的条带大小是一致的.弱的表达就是条带的density在knockout动物组织中
低于wildtype动物组织.
您说的对,发表的WB图是很容易把弱的background去除掉.但这个事实还是存在,欺骗不
了自己啊. |
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h**********r
发帖数: 671 | 16 定量SDS-PAGE表达的条带有什么free的软件啊？就是想看看特定的条带占总量的百分比
之类的。多谢！ |
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g*****n
发帖数: 241 | 17 谢谢大家的回复，我试试把曝光时间弄长点看能不能看到两条带。有可能是PTM导致了
其中一条带不容易被我的抗体识别。
可惜我们只有一个自己的抗体，否则可以按照culater94的建议试试两端不同的。 |
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m****m
发帖数: 395 | 18 这次加了BME了，还是有这个现象，明明是同一个蛋白，在不同泳道上，却跑得一前一
后，虽然间隔极近，几乎就快要一直线了，但是还是有明显的前后。我用FPLC分离的，
看曲线分段取样，然后跑在不同的道上，其实肯定是同一个东西，条带很深，杂蛋白不
带HIS-TAG，之前WASH步骤应该就洗掉了，不可能结合得那么牢，最后ELUTE的时候下来
一大堆，肯定是样品，但是不知道为什么还是这样。或者跟上样量也会有关吗？比如上
得多会跑得慢点？
我是提纯了用来测结构的，所以希望尽可能纯。 |
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e****p
发帖数: 354 | 19 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
)，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢 |
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e****p
发帖数: 354 | 20 请问这个随机引物是自己合成的还是可以直接买到的啊？
这样的话RT后 PCR会有很多条带吧，
谢谢！
“5 |
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m***o
发帖数: 272 | 21 看来老板没冤枉我吗？我是察了，但是如果就一轮PCR 看起来都还好，但是在继续nest
PCR 一轮就很容易出来了，明天我把试验台也察察看。为什么有些样品里面我怎么都
做不出条带，而这样阴性对照就容易出来。而且我现在都是先加阴性对照组的水，盖上
盖子，然后再做别的和阳性对照。我真不知道操作该怎么改进。或者我不该做阳性对照
组，可能都是它惹的。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 22 denatured plasmid which is resistant to enzymatical digestion
it's due to long time treatment of solution II(NaOH/SDS)
没有切过。最左边的是ladder，然后从左到右依次是冻在-20度的，藏在4度的和丢在室
温的。过了五天拿出来电泳，看看降解得怎么样了。如大家所见，最左边的条带（-20
度）看上去挺好，超螺旋 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 23 是这样啊。可是我刚刚抽提好的质粒，是没有这一条带的，放上几天才出现。是否放置
本身也会让质粒变性呢？
20 |
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g******u
发帖数: 66 | 24 最近被一个问题困扰着:
用某种通道蛋白的抗体(通过Western blot和immunohistochemistry) 来研究此蛋白在
一个组织中的表达情况.在大批量的实验前,先做了个预实验测试了下此抗体的特异性.
很奇怪的是,Western blot和immunohistochemistry 都显示在此蛋白完全敲除的动物组
织中还是有弱的阳性表达(和wild-type相比是很弱,但还是能看到非常弱的条带或者染
色).
难道是一抗或者二抗的浓度过大?还是封闭的不够?
注: 1. 此抗体已经有几篇发表的文章显示是特异性的
2. 基因敲除的动物应该没有问题
3. 弱的阳性表达应该不是来自自发荧光或者artifact
非常感谢您的建议和分析!!! |
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g******u
发帖数: 66 | 25 谢谢!没打算PS,这个技巧可不敢玩!
就是有点纳闷为什么已经发表的文章中KO动物的组织中连很弱很弱的条带都没有,完全
是干净的!!! |
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T*****n
发帖数: 897 | 26 作了一个PCR，本来是预期1000bp的带，但却出现了两条550和750的两条带。这是怎么
回事？还有另外两个片段，用正常捐血者的标本能搞得到预期的带，但开始测病人的样
本，却没有出现任何带。这是怎么回事？谢谢！ |
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c**a
发帖数: 94 | 27 那为什么有些sample有,有些sample里没有呢. 而且blot for total JNK的时候就没有
那条带 |
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D**F
发帖数: 54 | 28 最近用PCR鉴定 loxp小鼠
在flox区域两侧设计引物， 理论上WT 产物较短，floxed产物较长
但奇怪的是，要么只看到长的产物，要么只看到短的产物，从来没有见到过同时有长短
两条带
根据交配后代的结果显然那些只看到 长产物的小鼠中是有 loxp +/- 杂合体的
有人遇到过这种情况吗？
感觉是floxed allele在PCR中抑制了WT的扩增
但为什么会造成这种抑制实在想不明白 |
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t******y
发帖数: 716 | 29 应该是蛋白形成二聚体，外源蛋白和内源蛋白一起ip下来，flag的外源蛋白分子量大在
上面，内源蛋白本身在下面。蛋白的抗体可能识别的位点是和flag相连的末端，因为连
上flag反而不能识别外源蛋白了，所以只看到低一点的条带。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 30 这个蛋白有PTM? 如果这个Modification 正好在抗体的识别Epitope 上或者附近，会影
响抗体的识别吧？
把蛋白本身抗体曝光长点，说不定也能看见两条带？这个我倒遇见过，就是抗体对同一
蛋白不同状态有不同的敏感性。 |
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m**********2
发帖数: 6568 | 31 还有个终极办法就是把两条带都切了mass spec |
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发帖数: 1 | 32 韩春雨论文的实验结果是不是伪造的？
·方舟子·
河北科大副教授（据闻已突击评为正教授）韩春雨因发明基因编辑新技术，
被称为“诺贝尔级成果”，一夜成名，号称“诺公招手”了（注）。但是有多家
实验室反映重复不出其论文中最关键的图4结果。有人仔细研究图4图片，发现其
电泳结果不合理；还有人对这些图片做了亮度、对比度处理，发现有拼接的痕迹。
这是怎么回事呢？
我先给不是生物医学领域的读者粗略介绍一下其中的背景知识。论文图4是
对DNA片段做电泳的结果。DNA片段带有电荷，把它添加到凝胶中，放进缓冲液，
通上电，DNA片段就能在凝胶中移动，片段大的移动得慢，片段小的移动得快，
染色以后可以看出这些片段在哪里，再跟已知大小的标识片段做对比，就可以知
道片段的大小了。这就是所谓电泳。
论文图4a是对DNA进行了编辑后产生的不同片段进行电泳的结果。DNA是由一
个个核苷酸链接而成的，核苷酸越多，DNA片段就越大。经过剪切之后，图中的
G6和G13相差30个核苷酸。这个大小差别是不是能在电泳上看出来，取决于凝胶
的浓度和电泳的时... 阅读全帖 |
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U*******n
发帖数: 824 | 33 在导师任先达的指导下完成学位论文一个月后，李红良迎来了答辩。这也意味着他在暨
南大学药学院药理学专业的三年硕士学业即将结束。那是在2002年的5月。在《致谢》
部分，李红良说，导师三年来对他的教诲，“令学生终生受益”。
的确，这三年，师生二人的合作可谓“硕果累累”。在这本73页的硕士学位论文中列出
了期间发表的14篇文章（7篇英文，7篇中文）——除去两篇外，李均是第一作者；而其
导师则是绝大多数文章的通讯作者。
作为一名硕士研究生，李的创记录的“高产”引起一片哗然。2001年在其他绝大多数学
生还没有来得及收结果的时候，他就发论文了，而且一发不可收拾，当时就有同学举报
，药学院领导查了，但不了了之。
时光飞逝，当年的硕士“小李”，在获得北京协和医科大学博士，经历2年多国外博士
后，2008年11月从多伦多回到了武汉大学人民医院（当年3月以李红良为第一作者出版
的一篇论文随后被撤稿），并成为了教授。几年下来，李红良组建了据说是100多人的
研究团队，更有“杰青”，“长江”加身，事业可谓如日中天。
然而，2017年是他喜忧参半的一年。喜的是他一年发了5篇《自然医学》论文，忧的是
有举报人向... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 34 ◇◇新语丝(www.xys.org)(newxys.com)(xys10.dxiong.com)◇◇
再说饶毅、管坤良实验室联合发表的论文数据造假
·方舟子·
昨天我发出《关于饶毅、管坤良实验室联合发表的论文数据造假的分析》后，
饶毅转给我他当天登在其微信公众号的文章《饶毅、管坤良就论文图片的分析》
（以下简称饶文），作为对“有人匿名散发指饶毅参与署名的9篇论文中图片有
造假问题”的回应。由于第6、7、8、9等四篇文章“不存在需要解释的地方”，
饶文称只需回应第1、2、3、4、5等五篇文章——对此我也同意，我在前文也只
分析了这五篇论文。
但是实际上饶文只回应了“饶毅需要负质量和监管责任的图片”，指的是这
两篇论文中的图片：
论文1：
J Neurosci. 2007 Jan 24; 27(4): 957–968.
p130CAS Is Required for Netrin Signaling and Commissural Axon
Guidance
Guofa Liu, Weiquan Li, Xue Gao,1,2 X... 阅读全帖 |
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f***y
发帖数: 4447 | 35 https://m.toutiao.com/i6499743832802853390/
1973年，匈牙利数学家 László Fejes Tóth 在 Exploring a Planet 一文中提出了
球带猜想（Zone Conjecture）[1]。该猜想描述了如果一个单位球面被几个球带完全覆
盖，它们的宽度总和至少为 π。44年过去了，以色列理工学院（Technion）的中国数
学家姜子麟和莫斯科物理技术学院（MIPT）的 Alexandr Polyanskii 终于证明了
Fejes Tóth 的猜想，其结果发表于GAFA数学杂志 [2]。他们的证明对于离散几何非常
重要。
○ László Fejes Tóth 猜想。半径为1的单位球体被等宽的区域覆盖。所有区域的
宽度总和的最小值是π。每个区域用不同颜色标记。| 图片来源：MIPT
离散几何学（Discrete Geometry）研究的是点、线、圆、多边形和其他几何对象的组
合性质。例如它会考虑如下问题：在一个球的周围，最多能摆放多少个相同尺寸的球在
它周围？或者，在平面上，如何以最密集的方式排放相同大小的圆？又或者在空间... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 36 武汉市地质构造和城市规划建设浅谈
老K世界观
老K世界观
热爱城市规划建设、商业地产和历史的武汉佬
51 人赞同了该文章
地质学和城市规划学是两门专业性极强的学科，如果再结合运用在一个具体的特大城市
进行分析研究，那可以写一本厚书了。
作为一名城建规划的爱好者，看着满城挖、满城建的武汉，总在想：为啥摩天不能建这
里？为啥商务区这样规划？为啥隔壁地铁那么多，我们这还不修？
带着疑问，我参看了1990年至2015年多个高校和机构的相关文献资料，渐渐我越来越了
解了，现在把文献资料的分析结论简单归纳如下，抛砖引玉，如有错误和遗漏，请大神
指出。
武汉地质概况
武汉是一个山水城市，地处华中腹地，位于长江与汉江交汇处，在江汉平原以东，素有
“九省通衢”之称。从土地资源承载力来看，武汉市国土面积仅次于北京、天津，是香
港的八倍。城区地处江汉平原与鄂东南大别山区丘陵、山地的交接地带，地质构造比较
复杂，同时也是一个地壳相对稳定的地区。
中国传统的“风水”和现代的城市规划地质学研究
古人讲究天人合一，在修建房屋之前要“相土尝水”，选择“风水”较好的地段。随着
西方的科学技术的进入，形成了城市规划学和地... 阅读全帖 |
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b******n
发帖数: 4225 | 37 1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好
抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是... 阅读全帖 |
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i****g
发帖数: 3896 | 38 写得比较有意思，但是不太实用，可能实验条件相差太大。precast gel比自己制的gel
效果要好很多，结果也容易重复。antibody要看运气的，呵呵。
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这... 阅读全帖 |
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w********h
发帖数: 12367 | 39 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: bulletin (bulletin), 信区: Biology
标 题: 穷人的劳斯莱斯——五年western经验谈（转）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 2 23:29:05 2012, 美东)
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10... 阅读全帖 |
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O******e
发帖数: 4845 | 40 ☆─────────────────────────────────────☆
yuuli (听，...听) 于 (Thu Nov 16 23:23:06 2006) 提到:
http://www.cell.com/content/article/fulltext?uid=PIIS0092867406012256&highlight=polymerase
Cell, Vol 127, 317-327, 20 October 2006
Role of the Sigma Factor in Transcription Initiation in the Absence of Core
RNA Polymerase
Hsin-Hsien蔋su,1 Kuei-Min蔆hung,1 Tsung-Ching蔆hen,1 and Ban-Yang蔆hang1,*
1 Institute of Biochemistry, National Chung-Hsing University, Taichung 40227
, Taiwan, Republic of China
从第二个图... 阅读全帖 |
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t******y
发帖数: 716 | 41 不同蛋白因为侧链的酸碱性，疏水性，电荷性等差异，往往在电泳中跑出来的图形会有
差异，也就是相同的蛋白起条带往往比较类似。这里的图形是指，条带的形状，边缘是
否圆润，像我前面举的例子fig6b，actin的条带表现为底部宽，顶部为圆弧形，而这与
曹文章中其他actin的条带形状相反，其他的actin条带是底部为圆弧形，顶部为宽的直
线。根据蛋白电泳的方向，actin从上往下跑，电泳前沿形成圆弧形似乎更加有道理，
所以，我觉得fig6b的actin图形应该以平行纸面为轴，作180度旋转。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 42 应该不是上样量的问题，我striping后（或者跑的久一点，从45kD处剪开），用beta-
actin杂交，内参的信号已经非常强了，而内源性的c-myc还是很弱。
我用过的两家c-myc的抗体都能杂处很多条带，其中在48-65kD之间有三条条带，转入质
粒过表达显示最上面的条带才是c-myc的（有抗体公司说是表观分子量68kD，有文章说
是64kD，不过所指的是同一条带）。你可以参考这篇文章Nucleolar localization of
hepatic c-Myc: a potential mechanism for c-Myc regulation
关于内源性c-myc杂交很弱的问题，我查过很多文章，多数都是杂带很多，64kD处很弱
。有个别条带很专一，信号很强的，我很怀疑，因为我知道有人拿其它抗体，比如
actin抗体做了个figure，然后说是c-myc杂交的，还发了不错的文章。 |
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z****i
发帖数: 35 | 43 Caspase-1前体分子量是45kD，剪切后变成20kD的和10kD的蛋白，买的两种抗体能够同
时检测前体和p20，做了很多次都是45kD的位置很多条非特异条带，都分辨不出来目的
条带了，不过条带倒是很浓。20kD的则很淡，基本看不见，把曝光时间增加到很长也还
是很淡，若隐若现的。保证加的刺激能活化Caspase-1。
大家谁这个分子比较有经验，能否指点一下怎么才能跑出来20kD的那条带啊？......用
的是sigma和abcam的抗体。
也试过专门跑小分量的蛋白胶，45kD的带还行，20kD的那条带都不怎么成型了，斑斑点
点的，是不是转膜没转好呢？
谢谢啦！ |
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m***o
发帖数: 272 | 44 western blot上在别的组织上有个短的条带在WT上有，但是在knockout上就消失，别的
非特异条带没有变化。但是我现在觉得这个我找到的shortform不是看到的那个条带，
因为根据这个序列推测蛋白要小很多。
现在我比较确定这个shortform mRNA 的表达在我做的这个组织上很高，因为RT用这个
短的5UTR为forward primer（全长没有这个序列），可以看到很亮的条带，但是别的组
织没有。
我现在也有些不知该怎么往下做，因为抗体不是很好，很多非特异条带。 |
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F**********6
发帖数: 90 | 45 做了几次CHIP，每次对照IgG都能扩增出很弱的条带（实验组的条带很强！）。请问如
何解决对照IgG有弱条带的问题？
看了些别人发表的CHIP实验数据，绝大部份对照IgG基本上没有条带。但偶然能看到一
两篇文章里的CHIP实验数据里的对照里有弱的条带。
多谢指教 |
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H****n
发帖数: 26 | 46 最近做一个Transcription Factor（120KD）的ChIP， 很奇怪的事情，--
前面标准的1% formaldyhe RT 10min，0.125M Glycine RT 5 min, PBS wash,
裂解完细胞后，温和的sonication完后，input用western看发现原来条带的位置没有（
或者变的很淡），在下面有两条小的蛋白带。 做了一下RNA pol-II的WB (>150kD <
200kD)也是类似的情况，原来条带的位置淡了很多，在底下出现了两三条size小的条带。
先后试了RIPA (0.1%SDS)和nuclear lysate(1%SDS)裂解，效果一样。只要有
sonication,即使是很温和的5个cycle 30s/30s (该条件下DNA shear都不完全200-
3000bp), 原来蛋白条带就会消失，取而代之的是底下出现的size小的条带。
请问这是sonication 导致大分子量的蛋白容易降解吗？要如何解决？ |
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发帖数: 1 | 47 关于电泳条带的拖尾问题
方先生：
您好！
我是您的超级粉丝，从“基因皇后”事件就开始关注新语丝，一直到现在，
只要打开浏览器，肯定要到新语丝上看一看。
看了7月20号关于韩春雨的文章，不谈其它，我只就电泳条带的拖尾现象谈
一下我的认识。
一般情况下，电泳条带拖尾状况正如方先生所说，边缘拖后，中间超前。我
原先也是一直是这样认为的，但是正是这样的认识，差点冤枉了一个研究生。有
一年研究生预答辩时，我看到同组老师的一个研究生ppt中一张蛋白电泳图非常
特别，蛋白条带中间拖后，边缘超前。我就问学生为什么会这样？这个学生说他
也不知道为什么，跑出来的结果就是这样的。maker也是这样。我非常怀疑，但
是保险起见，我没有再争论下去，而是会后自己查了一下，终于发现了原因。他
的蛋白电泳分析的是超低分子量蛋白，用的是Tricine-SDS-PAGE，在这种条件下，
加上电泳仪电压不均衡等其它原因，小分子量蛋白的确会出现边缘超前，中间拖
后的结果。请看网上的一些图片：
http://www.chem17.com/offer_sale/detail/11291438.... 阅读全帖 |
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r**a
发帖数: 121 | 48 我们实验室用的一个主要的抗体
是以杂交瘤细胞上清的形式存放在－80度冰箱
存放了15年了（95年的）
现在情况是
western在细胞上不怎么好
大部分时候，杂带多，在目的条带处也有3个条带
有可能是磷酸化，但是每次三个条带之间的分布不同
但如果进行组织样品的western
有时能得到一个还可以的条带
稀释倍数从1：20到现在1：5
所以，我想复苏细胞重新弄点抗体
但是，老板和一个资深博士都说
抗体这样可以保存很长时间，绝对没有问题的
（因为我们这样的抗体在－80度还有很多保存着）
所以，询问一下这里的前辈
是不是真的这样保存，抗体很稳定？ |
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f*********r
发帖数: 1233 | 49 与细胞/组织匀浆不同，血清中dna极低。粘稠主要因为蛋白和血脂。楼上说超高速离心
，是个不错的办法。能够去掉很多悬浊微粒。如果样品量有限，可以加过lysis buffer
以后再离心。
稀释总蛋白浓度。如果5ul/well这个量不能再降低，可以象楼上所说，用大胶、厚胶，
想办法增加volume/well。
如果有条件，可以用filter过滤掉不需要的蛋白。一般，条带扭曲多发生在小分子量。我估计你要的蛋白就不大。那么，你可以根据分子量，过滤掉大分子蛋白。millipore就有很多不同孔径的过滤系统可供选择。
条带形状不规整，很大程度上还因为蛋白denature得不够好。可以适当在loading buffer里增加sds浓度。
由于loading buffer与running buffer之间在表面活性上有差异，可以造成条带的扭曲
。为此，可以选用taurin buffer（代替glycin buffer）以弱化条带扭曲。甚至，有的
pi曾经建议，在上样之前，空跑至少10分钟。
用一般的样品跑胶，那么胶的品牌与型号之间的优劣不是很明显。你的sample比较特殊
，可能就放大了各厂家产品之间 |
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