Y**********j
发帖数: 369 | 1 失去了自己的idea，只是一个很小的问题，就像高人指点的那样，“idea is
cheap”，我心领神会，后面再也不提了它了。
但是树欲静，风不止，老板狂热的开始研究这个潜在的enhancer区域，我也算参与
其中了。他有一个病人的DNA标本，无论enhancer或coding region都检查不出任何大的
DNA deletion，所以放在那里一直没有结论，现在忽然成了最好的检验enhancer功能的
对象。我被要求扩增enhancer区域并去测序，看看有什么问题。我做的很顺利，第一轮
PCR能看到很单一的条带，只是太弱，不得已作第二轮PCR，条带很漂亮，心里一块石头
落地了。电泳检测时候，发现和正常对照有几百bp的差别，我很敏感这种差异，就向老
板报告了。他让我重复一遍电泳，看得更清楚了，或许真的钓到大鱼了吧，老板很是兴
奋。我虽然不像老板那么兴奋，但起码我参与的这一块有些可作的东西，也不是坏事吧。
不一会，老板又跑过来找我，说有问题。他的疑问在于，PCR产物只有一条带，但我们
研究的疾病从来没有听说过纯合子缺陷型。这里需要介绍一下我们研究的背景。我们研
究的是一种完全致死型的新生儿疾病，致病基因的promoter 和coding region在父源基
因组被甲基化所imprint所以不能表达，只有母源基因组可以表达。一旦母源基因组致
病基因的任何关键区域发生突变或缺失，就会导致病人死亡。那么这种突变就会从人群
中消失，所以在这类疾病的突变应该都是新产生的。这是目前公认的理论，老板也深信
不疑。对此我也有了解，但我毕竟是新入行的，对这个领域的水有多深，并没有清晰的
认识。我仅仅从PCR的结果告诉他如果是deletion，那么就是纯合的。他的脸色大变，
申斥我不懂遗传学，我的命运就此发生了转折。
我从来不迷信任和理论，尤其是当理论和实践发生了冲突的时候；我是遗传专业毕业的
，我也不能认同他对我的评价。我仔细研究了电泳图，根据DNA marker发现实际上病人
的PCR产物是接近理论预期的，而对照则明显偏大，换句话说，对照DNA可能有
duplicate。这个分析我也同其他博后商讨过，他们也同意我的看法，我于是又向老板
谈了，他还是坚持认为deletion是存在，只是我的PCR有问题。我被逼到角落了，连PCR
都做得有问题，博后怎么混呢？我得给老板一个解释。我建议立即测序，来看看问题何
在；但老板是个急性子的人，逼着我立即给出合理的解释，他不可能等到几天以后看到
测序结果再解决这个问题。
我事后思考了一下，老板为什么一定认定是deletion呢？看来只能是这样的，他的
文章急需这方面的证据来说明enhancer区域的功能，这个疑似deletion给了他太大的希
望；但理论预测和实验结果又是相违背的，这可能动摇他文章的理论基石。所以他对我
不依不饶，一定要给个说法；而我不得不在他的强制前提下寻求一个合理的解释。我静
静的思考了一个小时，心中豁然开朗，然后和另一个博后花了半个小时演绎了我的思路
，他表示完全赞同。
解释是这样的。如果deletion发生在enhancer区域，有两种可能性：如果发生在母
源基因组，致病基因不能表达，人会死，deletion突变会消失；如果发生在父源基因组
，致病基因正常表达，该携带者一切正常的，这就是imprint导致表型或死或生没有中
间表型的结果。在母源配子发生过程中，这个imprint将被去除并成为下一代母源基因
，死亡也将不可避免，这个突变还是消失了。那么enhancer区域突变的纯合子应该是不
可能存在的。但问题在于，我发现如果另一个染色体等位的enhancer能激活不在同一个
染色体上的致病基因的正常表达，这个deletion还是可以继续存在下去的。我立即搜索
了相关文献，人类疾病研究确实没有相关的报道，但在果蝇模型中已经有相关的研究证
实这个观点。我立即打电话和我的同学和熟人讨论了这个观点，大家都是这个领域长期
干的，但都从来没有听说这个理论，也找不出这个理论的错。和做果蝇的那家实验室交
流以后，确证理论上是可行的，但学术界并没有广泛接受这个观点。
我明白了这个理论的重要性，立即向老板报告。我从来没有看过老板是那么的紧张
，他脑子的想法我可能永远也不会真正明白的。测序的结果证实有一些小的突变，但不
是纯合的，它证实了我开始想法，那个小小的差异只是一个美丽的错误，老板也不再关
心正常基因会不会有duplicate.我的理论其实也和这个病例没有任何关连了，它是一个
崭新的疾病模型，它的研究前景无可限量。但我的末日快要来到了，若干个星期之后，
我将要离开这个领域，甚至离开这个国度。我用中文写下我的想法，希望华人学者们能
够在mitbbs上看到它，并且接着做下去，也算我在人类医学遗传学这个领域短短几个月
的经历中能留下一点点痕迹。
欢迎这方面的研究者能发表你们的看法，或者站内联系，同你们讨论这个问题是我
无上的荣幸！ |
M*****n
发帖数: 16729 | |
b******e
发帖数: 3348 | 3 "我仅仅从PCR的结果告诉他如果是deletion，那么就是纯合的。他的脸色大变，
申斥我不懂遗传学"
"测序的结果证实有一些小的突变，但不
是纯合的，它证实了我开始想法，那个小小的差异只是一个美丽的错误，"
感觉你说的前后矛盾啊，你一开始的想法不是说是纯合吗？ |
v*******a
发帖数: 759 | 4 看贴不仔细，人都说了是对照样品有duplication
【在 b******e 的大作中提到】
: "我仅仅从PCR的结果告诉他如果是deletion，那么就是纯合的。他的脸色大变，
: 申斥我不懂遗传学"
: "测序的结果证实有一些小的突变，但不
: 是纯合的，它证实了我开始想法，那个小小的差异只是一个美丽的错误，"
: 感觉你说的前后矛盾啊，你一开始的想法不是说是纯合吗？
|
d***y
发帖数: 1850 | 5 没看懂你为什么要离开这个领域了。。
就为了这个你老板要炒了你？ |
b******e
发帖数: 3348 | 6 那是老板说lz不懂遗传学以后lz自己再仔细分析以后，所以刚开始的时候lz自己的想法
也是错误的吧。
【在 v*******a 的大作中提到】
: 看贴不仔细，人都说了是对照样品有duplication
|
n***w
发帖数: 2405 | |
s******y
发帖数: 28562 | 8 你的老板貌似很不厚道。
还是离开他吧
吧。
【在 Y**********j 的大作中提到】
: 失去了自己的idea，只是一个很小的问题，就像高人指点的那样，“idea is
: cheap”，我心领神会，后面再也不提了它了。
: 但是树欲静，风不止，老板狂热的开始研究这个潜在的enhancer区域，我也算参与
: 其中了。他有一个病人的DNA标本，无论enhancer或coding region都检查不出任何大的
: DNA deletion，所以放在那里一直没有结论，现在忽然成了最好的检验enhancer功能的
: 对象。我被要求扩增enhancer区域并去测序，看看有什么问题。我做的很顺利，第一轮
: PCR能看到很单一的条带，只是太弱，不得已作第二轮PCR，条带很漂亮，心里一块石头
: 落地了。电泳检测时候，发现和正常对照有几百bp的差别，我很敏感这种差异，就向老
: 板报告了。他让我重复一遍电泳，看得更清楚了，或许真的钓到大鱼了吧，老板很是兴
: 奋。我虽然不像老板那么兴奋，但起码我参与的这一块有些可作的东西，也不是坏事吧。
|
s*****8
发帖数: 86 | 9 虽然不知道你们在说什么，但是好像很厉害的样子！！ |
h******y
发帖数: 351 | 10 我的建议是，在和老板争论是否有deletion之前，利用其他的办法证实你的PCR所发现
的结果。PCR是很容易出错的，如果你能利用Southern证实homozygous的deletion确实
存在，相信你的老板是会接受你的结论的。
Constance L. Cepko实验室最近retract了G&D上的一篇文章，很好的说明了PCR的易错
性。有兴趣的可以看看。
http://genesdev.cshlp.org.mutex.gmu.edu/content/25/12/1344.long
“We are writing to clarify the interpretation of the results from our above
-mentioned paper. In this study, we used two methods to examine the
structure of RNA from the mouse Math5 (Atoh7) locus. Our initial
characterization was an analysis of the Math5 RNA structure using RT/PCR. We
designed several sets of primers to interrogate the 5′ untranslated region
(UTR) and 3′ UTR, as well as the coding region (CDS). The RT/PCR gave a
surprising result. It appeared that the majority of the Math5 RNA molecules
did not contain a CDS, but were short transcripts with the 5′ and 3′ UTRs
joined together. We were surprised by this finding, and were aware that
there are many artifacts created by RT and/or PCR. Rather than alter the
conditions for these reactions, we chose to verify this finding using a
different method, one that we thought would not be susceptible to the same
artifacts as RT and PCR. We thus examined Northern blots using retinal RNAs
and probes made for the CDS and each of the UTRs. The results from the
Northern blot seemed to confirm that there were two Math5 RNA species: a
larger one that had the CDS, and a smaller one that contained the UTRs but
not the CDS. These data were consistent with the RT/PCR results, and we took
these data to mean that the majority of the Math5 RNA species did not
contain the CDS.
“Prasov et al. (2010) have recently published an examination of the Math5
RNA structures using the same RT/PCR primers as used in our study. They can
find the same RT/PCR products using the primers and conditions that we
described. However, they were able to show that the short products that
appear to be missing the CDS are due to a very tight secondary structure,
which causes RT to switch strands or otherwise skip the CDS, likely due to
an 85% GC domain in the CDS. After they published their findings, we
understood how we incorrectly interpreted the RT/PCR products. We have since
gone back and probed Northern blots using the same RNA probes used in our
original study. We have now purified the probes using two different
protocols. In addition, we washed the Northern blots using different levels
of stringency. The probe preparation method and the washing conditions were
found to change the hybridization results with the CDS probe.
“The fact that two independent methods appeared to reinforce each other, to
give the interpretation of two different RNA species, was quite unfortunate
. It is likely that both the variability in the behavior of the probes on
the Northern blot and the RT skipping of the CDS were due to the region of
high GC content. In fact, the very high GC content might indicate that this
mRNA is regulated by this structure, which may lead to poor, or at least
regulated, translation of this protein. However, we no longer believe that
the majority of the RNA is spliced such that the CDS is eliminated.”
吧。
【在 Y**********j 的大作中提到】
: 失去了自己的idea，只是一个很小的问题，就像高人指点的那样，“idea is
: cheap”，我心领神会，后面再也不提了它了。
: 但是树欲静，风不止，老板狂热的开始研究这个潜在的enhancer区域，我也算参与
: 其中了。他有一个病人的DNA标本，无论enhancer或coding region都检查不出任何大的
: DNA deletion，所以放在那里一直没有结论，现在忽然成了最好的检验enhancer功能的
: 对象。我被要求扩增enhancer区域并去测序，看看有什么问题。我做的很顺利，第一轮
: PCR能看到很单一的条带，只是太弱，不得已作第二轮PCR，条带很漂亮，心里一块石头
: 落地了。电泳检测时候，发现和正常对照有几百bp的差别，我很敏感这种差异，就向老
: 板报告了。他让我重复一遍电泳，看得更清楚了，或许真的钓到大鱼了吧，老板很是兴
: 奋。我虽然不像老板那么兴奋，但起码我参与的这一块有些可作的东西，也不是坏事吧。
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P******8
发帖数: 122 | |
Y**********j
发帖数: 369 | 12 那是假设有deletion的情况，其实是control多了一段而已。老板不信，所以只有等测
序结果。
【在 b******e 的大作中提到】
: "我仅仅从PCR的结果告诉他如果是deletion，那么就是纯合的。他的脸色大变，
: 申斥我不懂遗传学"
: "测序的结果证实有一些小的突变，但不
: 是纯合的，它证实了我开始想法，那个小小的差异只是一个美丽的错误，"
: 感觉你说的前后矛盾啊，你一开始的想法不是说是纯合吗？
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Y**********j
发帖数: 369 | 13 找下家未必能在同一个领域，生存的需要会超过对一个领域的兴趣，这个大家其实都明
白的。
【在 d***y 的大作中提到】
: 没看懂你为什么要离开这个领域了。。
: 就为了这个你老板要炒了你？
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Y**********j
发帖数: 369 | 14 这一点我完全同意，但遗憾的是目前最好的办法就是PCR，不过我建议先坐一下克隆再
测序，这样结果比较好分析。PCR产物测序，效果很不好的，但为了快速测序老板坚持
这样，我也没有办法
above
We
【在 h******y 的大作中提到】
: 我的建议是，在和老板争论是否有deletion之前，利用其他的办法证实你的PCR所发现
: 的结果。PCR是很容易出错的，如果你能利用Southern证实homozygous的deletion确实
: 存在，相信你的老板是会接受你的结论的。
: Constance L. Cepko实验室最近retract了G&D上的一篇文章，很好的说明了PCR的易错
: 性。有兴趣的可以看看。
: http://genesdev.cshlp.org.mutex.gmu.edu/content/25/12/1344.long
: “We are writing to clarify the interpretation of the results from our above
: -mentioned paper. In this study, we used two methods to examine the
: structure of RNA from the mouse Math5 (Atoh7) locus. Our initial
: characterization was an analysis of the Math5 RNA structure using RT/PCR. We
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e***g
发帖数: 1696 | 15 好像很牛的样子，可惜完全看不懂，你都要走了，告诉他干嘛？
吧。
【在 Y**********j 的大作中提到】
: 这一点我完全同意，但遗憾的是目前最好的办法就是PCR，不过我建议先坐一下克隆再
: 测序，这样结果比较好分析。PCR产物测序，效果很不好的，但为了快速测序老板坚持
: 这样，我也没有办法
:
: above
: We
|
Y**********j
发帖数: 369 | 16 我自己以为当了多年的忍者神龟，什么实验室都能熬下去，这一次算是大开眼界。他不
让我走，其push的程度也让我坚持不了多久了。实验室剩下的三个人，包括老板，都是
单身汉，我这有家有口的博后，怎么生存呢？与其push到最后不得不走，不如因为学术
观点的不同先走，虽然也很艰难，但长痛不如短痛嘛
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的老板貌似很不厚道。
: 还是离开他吧
:
: 吧。
|
D*a
发帖数: 6830 | |
e***g
发帖数: 1696 | 18 就三个人的实验室耗个什么劲呢
【在 Y**********j 的大作中提到】
: 我自己以为当了多年的忍者神龟，什么实验室都能熬下去，这一次算是大开眼界。他不
: 让我走，其push的程度也让我坚持不了多久了。实验室剩下的三个人，包括老板，都是
: 单身汉，我这有家有口的博后，怎么生存呢？与其push到最后不得不走，不如因为学术
: 观点的不同先走，虽然也很艰难，但长痛不如短痛嘛
|
L*****s
发帖数: 24744 | 19 Idea is truly cheap if you don't try to realize it... |
Y**********j
发帖数: 369 | 20 I am trying but need a professor help. Now funding....
【在 L*****s 的大作中提到】
: Idea is truly cheap if you don't try to realize it...
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Y**********j
发帖数: 369 | 21 失去了自己的idea，只是一个很小的问题，就像高人指点的那样，“idea is
cheap”，我心领神会，后面再也不提了它了。
但是树欲静，风不止，老板狂热的开始研究这个潜在的enhancer区域，我也算参与
其中了。他有一个病人的DNA标本，无论enhancer或coding region都检查不出任何大的
DNA deletion，所以放在那里一直没有结论，现在忽然成了最好的检验enhancer功能的
对象。我被要求扩增enhancer区域并去测序，看看有什么问题。我做的很顺利，第一轮
PCR能看到很单一的条带，只是太弱，不得已作第二轮PCR，条带很漂亮，心里一块石头
落地了。电泳检测时候，发现和正常对照有几百bp的差别，我很敏感这种差异，就向老
板报告了。他让我重复一遍电泳，看得更清楚了，或许真的钓到大鱼了吧，老板很是兴
奋。我虽然不像老板那么兴奋，但起码我参与的这一块有些可作的东西，也不是坏事吧。
不一会，老板又跑过来找我，说有问题。他的疑问在于，PCR产物只有一条带，但我们
研究的疾病从来没有听说过纯合子缺陷型。这里需要介绍一下我们研究的背景。我们研
究的是一种完全致死型的新生儿疾病，致病基因的promoter 和coding region在父源基
因组被甲基化所imprint所以不能表达，只有母源基因组可以表达。一旦母源基因组致
病基因的任何关键区域发生突变或缺失，就会导致病人死亡。那么这种突变就会从人群
中消失，所以在这类疾病的突变应该都是新产生的。这是目前公认的理论，老板也深信
不疑。对此我也有了解，但我毕竟是新入行的，对这个领域的水有多深，并没有清晰的
认识。我仅仅从PCR的结果告诉他如果是deletion，那么就是纯合的。他的脸色大变，
申斥我不懂遗传学，我的命运就此发生了转折。
我从来不迷信任和理论，尤其是当理论和实践发生了冲突的时候；我是遗传专业毕业的
，我也不能认同他对我的评价。我仔细研究了电泳图，根据DNA marker发现实际上病人
的PCR产物是接近理论预期的，而对照则明显偏大，换句话说，对照DNA可能有
duplicate。这个分析我也同其他博后商讨过，他们也同意我的看法，我于是又向老板
谈了，他还是坚持认为deletion是存在，只是我的PCR有问题。我被逼到角落了，连PCR
都做得有问题，博后怎么混呢？我得给老板一个解释。我建议立即测序，来看看问题何
在；但老板是个急性子的人，逼着我立即给出合理的解释，他不可能等到几天以后看到
测序结果再解决这个问题。
我事后思考了一下，老板为什么一定认定是deletion呢？看来只能是这样的，他的
文章急需这方面的证据来说明enhancer区域的功能，这个疑似deletion给了他太大的希
望；但理论预测和实验结果又是相违背的，这可能动摇他文章的理论基石。所以他对我
不依不饶，一定要给个说法；而我不得不在他的强制前提下寻求一个合理的解释。我静
静的思考了一个小时，心中豁然开朗，然后和另一个博后花了半个小时演绎了我的思路
，他表示完全赞同。
解释是这样的。如果deletion发生在enhancer区域，有两种可能性：如果发生在母
源基因组，致病基因不能表达，人会死，deletion突变会消失；如果发生在父源基因组
，致病基因正常表达，该携带者一切正常的，这就是imprint导致表型或死或生没有中
间表型的结果。在母源配子发生过程中，这个imprint将被去除并成为下一代母源基因
，死亡也将不可避免，这个突变还是消失了。那么enhancer区域突变的纯合子应该是不
可能存在的。但问题在于，我发现如果另一个染色体等位的enhancer能激活不在同一个
染色体上的致病基因的正常表达，这个deletion还是可以继续存在下去的。我立即搜索
了相关文献，人类疾病研究确实没有相关的报道，但在果蝇模型中已经有相关的研究证
实这个观点。我立即打电话和我的同学和熟人讨论了这个观点，大家都是这个领域长期
干的，但都从来没有听说这个理论，也找不出这个理论的错。和做果蝇的那家实验室交
流以后，确证理论上是可行的，但学术界并没有广泛接受这个观点。
我明白了这个理论的重要性，立即向老板报告。我从来没有看过老板是那么的紧张
，他脑子的想法我可能永远也不会真正明白的。测序的结果证实有一些小的突变，但不
是纯合的，它证实了我开始想法，那个小小的差异只是一个美丽的错误，老板也不再关
心正常基因会不会有duplicate.我的理论其实也和这个病例没有任何关连了，它是一个
崭新的疾病模型，它的研究前景无可限量。但我的末日快要来到了，若干个星期之后，
我将要离开这个领域，甚至离开这个国度。我用中文写下我的想法，希望华人学者们能
够在mitbbs上看到它，并且接着做下去，也算我在人类医学遗传学这个领域短短几个月
的经历中能留下一点点痕迹。
欢迎这方面的研究者能发表你们的看法，或者站内联系，同你们讨论这个问题是我
无上的荣幸！ |
s******y
发帖数: 613 | |
b****r
发帖数: 17995 | 23 啥玩意啊，你不自己都说了 根据DNA marker发现实际上病人
的PCR产物是接近理论预期的，而对照则明显偏大，换句话说，对照DNA可能有
duplicate
你测个序不就知道了，整出来这么个玄幻的假说干嘛 |
m******5
发帖数: 1383 | 24 要泼冷水了
楼主，测序啊，不测序你就这么信这个PCR条带？
另外，你的PCR按照你的说法是re-PCR，很可能是PCR过程中的deletion |
U******m
发帖数: 2349 | 25 co-真悲壮
【在 s******y 的大作中提到】
: 真悲壮
|
d********f
发帖数: 43471 | 26 我一看这类文章就对整个人类的命运感到担忧，这一团浆糊的逻辑如果用在治病救人，
难道玛雅预言是真的
吧。
【在 Y**********j 的大作中提到】
: 失去了自己的idea，只是一个很小的问题，就像高人指点的那样，“idea is
: cheap”，我心领神会，后面再也不提了它了。
: 但是树欲静，风不止，老板狂热的开始研究这个潜在的enhancer区域，我也算参与
: 其中了。他有一个病人的DNA标本，无论enhancer或coding region都检查不出任何大的
: DNA deletion，所以放在那里一直没有结论，现在忽然成了最好的检验enhancer功能的
: 对象。我被要求扩增enhancer区域并去测序，看看有什么问题。我做的很顺利，第一轮
: PCR能看到很单一的条带，只是太弱，不得已作第二轮PCR，条带很漂亮，心里一块石头
: 落地了。电泳检测时候，发现和正常对照有几百bp的差别，我很敏感这种差异，就向老
: 板报告了。他让我重复一遍电泳，看得更清楚了，或许真的钓到大鱼了吧，老板很是兴
: 奋。我虽然不像老板那么兴奋，但起码我参与的这一块有些可作的东西，也不是坏事吧。
|
h******1
发帖数: 384 | 27 是这样的。Re-PCR的出问题的可能性很大。产物最少作1-2个梅切看看是否符合预期，
然后测序。现在就下结论太太太太早了。
【在 m******5 的大作中提到】
: 要泼冷水了
: 楼主，测序啊，不测序你就这么信这个PCR条带？
: 另外，你的PCR按照你的说法是re-PCR，很可能是PCR过程中的deletion
|
m**********n
发帖数: 299 | |
