l****j
发帖数: 70 | 1 我用一种抗体检测出了两条带，一般都认为目的条带在25KDa左右，但是我发现在50KDa
上面还有另外一条，left line是对照组，right line是过表达另外一种蛋白质后，
25KDa的表达减少，50KDa上面的条带表达增多而且分子量更高了，
这是什么情况？是蛋白质修饰 or 两种蛋白质binding or self-dimer?怎样能检测出来
？
哪位有经验的前辈帮忙分析一下吧，先谢过 |
e****s
发帖数: 1125 | 2 我会先试Co-IP
对于self-dimer,标上不同的tag，用一个Co-IP或者pull-down另一个。
50KDa
【在 l****j 的大作中提到】
: 我用一种抗体检测出了两条带，一般都认为目的条带在25KDa左右，但是我发现在50KDa
: 上面还有另外一条，left line是对照组，right line是过表达另外一种蛋白质后，
: 25KDa的表达减少，50KDa上面的条带表达增多而且分子量更高了，
: 这是什么情况？是蛋白质修饰 or 两种蛋白质binding or self-dimer?怎样能检测出来
: ？
: 哪位有经验的前辈帮忙分析一下吧，先谢过
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l****j
发帖数: 70 | 3 以前试过IP了，IP的过表达蛋白质的HA-tag，IB的我第一个图贴的抗体,分子量都在25
左右，但是这俩蛋白质一个在内质网一个在线粒体，不知道怎么binding到一起的，
如果直接在PVDF膜上测序，能得到可靠的数据吗？
【在 e****s 的大作中提到】
: 我会先试Co-IP
: 对于self-dimer,标上不同的tag，用一个Co-IP或者pull-down另一个。
:
: 50KDa
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l******n
发帖数: 143 | 4 这个俺尝试回答一下
1.你的gel是native or denatured?如果是denatured,一般非共价键的homo-dimer会分
离成monomer.
2.似乎不太明白你的描述left lane and right lane哪个蛋白被过表达?
3.可以跑个简单的MALDI-TOF质谱检测一下那个>50 kD的band是不是确定存在
4.如果你的gel是native gel without reducing reagent,你的蛋白质(们)会不会在空
气中氧化形成共价disulfide bond,可以很简单地加点还原剂做对比实验.
5.条件允许的情况下用分析超高速离心sedimentation velocity analytical
ultracentrifugation跑几个不同浓度的样品,看一看有没有reversible dimerization
进行,或者这两个条带分别是两个不相互作用的蛋白质,这个方法比SEC柱子resolution
高很多.
6.co-IP的artifect不少,最好用其他方法检验来确认
希望能帮到你哈
50KDa
【在 l****j 的大作中提到】
: 我用一种抗体检测出了两条带，一般都认为目的条带在25KDa左右，但是我发现在50KDa
: 上面还有另外一条，left line是对照组，right line是过表达另外一种蛋白质后，
: 25KDa的表达减少，50KDa上面的条带表达增多而且分子量更高了，
: 这是什么情况？是蛋白质修饰 or 两种蛋白质binding or self-dimer?怎样能检测出来
: ？
: 哪位有经验的前辈帮忙分析一下吧，先谢过
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l****j
发帖数: 70 | 5 多谢回复！
1.denature的western blot gel
2.右边是过表达的。
3.直接在膜上测吗？我再找找方法。以前用IP的gel做过测序，50多KDa附近的都被
heavy chain cover了。
4.native gel 不加还原剂，蛋白质的分子量都变了吧。我做的是denature的，加了巯
基乙醇。
5.分析超高速离心机没有的。
6.我也在找避免artifect的方法。
dimerization
resolution
【在 l******n 的大作中提到】
: 这个俺尝试回答一下
: 1.你的gel是native or denatured?如果是denatured,一般非共价键的homo-dimer会分
: 离成monomer.
: 2.似乎不太明白你的描述left lane and right lane哪个蛋白被过表达?
: 3.可以跑个简单的MALDI-TOF质谱检测一下那个>50 kD的band是不是确定存在
: 4.如果你的gel是native gel without reducing reagent,你的蛋白质(们)会不会在空
: 气中氧化形成共价disulfide bond,可以很简单地加点还原剂做对比实验.
: 5.条件允许的情况下用分析超高速离心sedimentation velocity analytical
: ultracentrifugation跑几个不同浓度的样品,看一看有没有reversible dimerization
: 进行,或者这两个条带分别是两个不相互作用的蛋白质,这个方法比SEC柱子resolution
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m****b
发帖数: 32 | 6 喜欢这样scientific的话题。
我是外行，很少做蛋白。我猜想能否把50kda的分析一下amino acid组成，如果和25的
一样，是否支持dimer，可以进一步证明呢 |
l****j
发帖数: 70 | 7 欢迎讨论啊！
我做蛋白但也是外行，很多不懂的。
我真正关心的并不是dimer的问题，如果是两个不同蛋白质之间binding就更好了。
【在 m****b 的大作中提到】
: 喜欢这样scientific的话题。
: 我是外行，很少做蛋白。我猜想能否把50kda的分析一下amino acid组成，如果和25的
: 一样，是否支持dimer，可以进一步证明呢
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