e***o
发帖数: 344 | 1 目前在做一个实验，要求检测到0.01 pg 以下的DNA模板. 现在我在做巢式pcr,大概能
检测到0.01 pg （1000 copy）.但是不稳定。不知道各位大虾有什么好的意见没有。谢
谢。 |
c******r
发帖数: 3778 | 2 你的pcr有问题，1000个copy很容易检测。理论上pcr可以检测到一个copy，但是一般到
10个copy以下就不太稳定了。
如果还检测不到，可以pcr之后跑个northern blog。 |
e***o
发帖数: 344 | 3 谢谢，回复。不知你pcr的时候有什么技巧。
对了忘了说一声，我的实验要求高保真。所以一些活性超强的酶不敢用。也不敢多加
mg2+, dmso之类的东西。 |
g******1
发帖数: 244 | 4 3轮巢式PCR灵敏性应该高很多，原理有一点像tail-PCR |
c******r
发帖数: 3778 | 5 你这个pcr做来干嘛用的？检测HIV？还是克隆什么东西？
【在 e***o 的大作中提到】
: 谢谢，回复。不知你pcr的时候有什么技巧。
: 对了忘了说一声，我的实验要求高保真。所以一些活性超强的酶不敢用。也不敢多加
: mg2+, dmso之类的东西。
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e***o
发帖数: 344 | 6 我需要transfect一些barcode，然后是用来测single barcode序列的。老伴没做过
bench work，天天说能检测到一个copy。不知道有没有法稳定到10copy去。你检测到10
个copy的PCR条件是什么.
【在 c******r 的大作中提到】
: 你这个pcr做来干嘛用的？检测HIV？还是克隆什么东西？
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c******r
发帖数: 3778 | 7 哦，酱紫
可是一般barcode都要先在clone细胞系，然后把扩增的细胞系拿来测序吧？不带直接一
个copy就测序的啊
这个吧，非常技术的问题，很难别人给troubleshooting，因为不知道技术细节。即使
知道，你也明白啦，有时候就是看手。比如你ld可能这个这个办法不行，但是换一个就
非常好，我可能正好相反。有时候就是很难说。
建议先把细胞clone了，这样多养点细胞就很容易测了。
10
【在 e***o 的大作中提到】
: 我需要transfect一些barcode，然后是用来测single barcode序列的。老伴没做过
: bench work，天天说能检测到一个copy。不知道有没有法稳定到10copy去。你检测到10
: 个copy的PCR条件是什么.
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e***o
发帖数: 344 | 8 院长同志！ ：）
谢谢回复。我就是要做单细胞，单barcode测序，用solexa测。但首先要扩增一下看看
，做control。你说的ld是指什么呢？ |
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c******r
发帖数: 3778 | 9 哈哈，ld是老伴的简称啊，呵呵
哦，酱紫，那真的只有一个copy啊。。。试试楼上说的，nest三轮吧。别的真的没啥好
办法了。
另外，可以中间加个probe，用qPCR做个test，看看amplification efficiency。
你看，DNA的平均分子量是330g/mol，如果100bp的product，那么平均分子量是660g/
mol。agarose gel加EtBr，100ng的DNA应该可以detect了吧？那么100ng大概合10e11个
copy的DNA double strand分子。
咱们如果assume PCR的效率是100%，那么就是那么一个copy要amplify到10e11大概需要
37个cycles。。。
如果PCR效率比较差，比如只有50%，那么需要62个cycles，所以啊，你看，最好先测一
下你的amplification efficiency。
【在 e***o 的大作中提到】
: 院长同志！ ：）
: 谢谢回复。我就是要做单细胞，单barcode测序，用solexa测。但首先要扩增一下看看
: ，做control。你说的ld是指什么呢？
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e***o
发帖数: 344 | 10 再次感谢回复。受益匪浅。我现在扩大概50个循环。但是已经开始有很多的非特异带。
不敢再往上增加了。不知道怎么除去。对了你说的10个copy，是指质粒吗？是怎么扩的
，用的什么酶啊。 |
e***o
发帖数: 344 | 11 再次感谢回复。受益匪浅。我现在扩大概50个循环。但是已经开始有很多的非特异带。
不敢再往上增加了。不知道怎么除去。对了你说的10个copy，是指质粒吗？是怎么扩的
，用的什么酶啊。 |
