r**********e
发帖数: 587 | 1 最近做DNA damage/repair的实验，
基本做法是blood cell先用MMS （Methyl methanesulfonate）treat大概2hrs，用PBS
洗干净，重新用新鲜的medium培养被损害过的cell让其进行repair，2hrs，4hrs,
24hrs
然后qPCR来扩增我感兴趣的genome region
我的预期是，MMS引起的dna damage比如double-strand break会在后面的2hrs, 4hrs,
24hrs自行修复
但qPCR出来的实验结果是：Ct value随着2hr, 4hr, 24hrs越来越大，也就是说DNA 含
量越来越小，和我的预期正好相反
不知道有没有做DNA repair的高手解释下这是咋回事？
谢谢 | T*****n
发帖数: 274 | 2 MMS之后用q-PCR直接检测基因组DNA在DNA repair领域可以说闻所未闻，没人知道PCR出来
的是什么,因为MMS诱导的damage类型很复杂，DSB只是可能性之一。取决与你想研究的
repair
pathway, MMS不一定是最好的agent.
对于MMS sensitivity, 比较经典的assay有survival curve, pulse field
electrophoresis，但这
些都不能说明特定区域的damage repair.
PBS
,
【在 r**********e 的大作中提到】
: 最近做DNA damage/repair的实验，
: 基本做法是blood cell先用MMS （Methyl methanesulfonate）treat大概2hrs，用PBS
: 洗干净，重新用新鲜的medium培养被损害过的cell让其进行repair，2hrs，4hrs,
: 24hrs
: 然后qPCR来扩增我感兴趣的genome region
: 我的预期是，MMS引起的dna damage比如double-strand break会在后面的2hrs, 4hrs,
: 24hrs自行修复
: 但qPCR出来的实验结果是：Ct value随着2hr, 4hr, 24hrs越来越大，也就是说DNA 含
: 量越来越小，和我的预期正好相反
: 不知道有没有做DNA repair的高手解释下这是咋回事？
| i**********a
发帖数: 1402 | | r**********e
发帖数: 587 | | r**********e
发帖数: 587 | 5 谢谢。
你说的非常对，PCR来检测DNA repair非常罕见
我要解释一下，
我压根不是做DNA damage/repair的，我有兴趣的一段疾病相关的序列repetitive
simple sequence，根据各种原因我相当怀疑是和DNA damage/repair相关的。我的
hypothesis是：这段疾病相关的repetitive序列或许更加vulnerable to 外界的DNA
damage， 或者DNA repair的修复能力跟其他普通序列不同，从而能为疾病机制提供新
的发现
我看了大部分DNA damage/repair领域的文章，我感觉大部分的工作都是global的比如
测量一下DNA损伤的marker比如H2AZ或者H3k56ac的level。但我的兴趣一定是需要精确
到DNA-specific或者gene-specific的
能精确到sequence-specific的我能想到的也就是PCR了
相关的研究也有，比如：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24371283
我顺便也好奇问下，repair领域大家是不care gene-specific只看宏观，还是大家觉得
qPCR approach不靠谱？
MMS或者H2O2或者其他reagent的诱导类型貌似都是多元的，但我不care到底是什么类型
的，PCR approach的基本逻辑就是因为damage所以诱导出各种各样的damage，比如DSB,
T-T dimer等等，这些damage都会影响PCR的efficiency
出来
【在 T*****n 的大作中提到】
: MMS之后用q-PCR直接检测基因组DNA在DNA repair领域可以说闻所未闻，没人知道PCR出来
: 的是什么,因为MMS诱导的damage类型很复杂，DSB只是可能性之一。取决与你想研究的
: repair
: pathway, MMS不一定是最好的agent.
: 对于MMS sensitivity, 比较经典的assay有survival curve, pulse field
: electrophoresis，但这
: 些都不能说明特定区域的damage repair.
:
: PBS
: ,
| T*****n
发帖数: 274 | 6 感觉你并不清楚你的locus of interest可能有什么样的DNA damage. DNA repair不同
领域的人用的assay是完全不同的，简直不能互相理解。一般来说，MMS damage repair
更多是用来test BER/NER pathway/factors，研究这些pathway很难用specific
endogenous locus. 对于DSB repair来说,MMS更多只是yeast领域里面用来suggest
epistatic relationship.
从你的描述，感觉你倾向于认为你的locus of interest可能undergo DSB upon
genotoxin stress. 检测最简单的方法就是genomic DNA southern blot for
rearrangements，或者gammaH2AX ChIP，PCR-based assay比如sequencing也可行if
PCR is possible. 当然前提是break frequency要比较高,不然什么assay都白搭。一些
比较fancy的next-gen sequencing方法在detect low level of breaks方面也很
powerful，但是你的sequence是simple repeats, bioinformatic方面可能稍微麻烦一
些。
【在 r**********e 的大作中提到】
: 谢谢。
: 你说的非常对，PCR来检测DNA repair非常罕见
: 我要解释一下，
: 我压根不是做DNA damage/repair的，我有兴趣的一段疾病相关的序列repetitive
: simple sequence，根据各种原因我相当怀疑是和DNA damage/repair相关的。我的
: hypothesis是：这段疾病相关的repetitive序列或许更加vulnerable to 外界的DNA
: damage， 或者DNA repair的修复能力跟其他普通序列不同，从而能为疾病机制提供新
: 的发现
: 我看了大部分DNA damage/repair领域的文章，我感觉大部分的工作都是global的比如
: 测量一下DNA损伤的marker比如H2AZ或者H3k56ac的level。但我的兴趣一定是需要精确
| r**********e
发帖数: 587 | 7 很感激。
的确我不知道locus of interest到底是什么damage，我totally外行
我是ChIP data发现这个repeats：
有H3K56ac的enrichment，同时也是BrdU enrichment的地方
BrdU意味着active DNA replication？而H3k56ac也是replication和damage response
相关
所以读了一堆文献，感觉经常看到的就是MMS可以induce DSB所以就先用MMS来下手（说
错了请指正）。敢问内行们，如果你们看到BrdU和H3K56ac这样的marker，会接着怎么
做呢
thx
repair
【在 T*****n 的大作中提到】
: 感觉你并不清楚你的locus of interest可能有什么样的DNA damage. DNA repair不同
: 领域的人用的assay是完全不同的，简直不能互相理解。一般来说，MMS damage repair
: 更多是用来test BER/NER pathway/factors，研究这些pathway很难用specific
: endogenous locus. 对于DSB repair来说,MMS更多只是yeast领域里面用来suggest
: epistatic relationship.
: 从你的描述，感觉你倾向于认为你的locus of interest可能undergo DSB upon
: genotoxin stress. 检测最简单的方法就是genomic DNA southern blot for
: rearrangements，或者gammaH2AX ChIP，PCR-based assay比如sequencing也可行if
: PCR is possible. 当然前提是break frequency要比较高,不然什么assay都白搭。一些
: 比较fancy的next-gen sequencing方法在detect low level of breaks方面也很
| r**********e
发帖数: 587 | 8 另外，我只是对某个特定位点有兴趣，直接PCR就可以了，应该不需要next-gen seq，
毕竟不是whole-genome的work
关于您说的break frequency的问题，的确是个很好的问题
我用不同浓度的MMS来treatment，发现是有很明显的qPCR的Ct值的变化的。我的PCR
amplicon才是400bp；而其实很多人担心break frequency太低所以都是做10kb的
amplicon的PCR来增大sensitivity
repair
【在 T*****n 的大作中提到】
: 感觉你并不清楚你的locus of interest可能有什么样的DNA damage. DNA repair不同
: 领域的人用的assay是完全不同的，简直不能互相理解。一般来说，MMS damage repair
: 更多是用来test BER/NER pathway/factors，研究这些pathway很难用specific
: endogenous locus. 对于DSB repair来说,MMS更多只是yeast领域里面用来suggest
: epistatic relationship.
: 从你的描述，感觉你倾向于认为你的locus of interest可能undergo DSB upon
: genotoxin stress. 检测最简单的方法就是genomic DNA southern blot for
: rearrangements，或者gammaH2AX ChIP，PCR-based assay比如sequencing也可行if
: PCR is possible. 当然前提是break frequency要比较高,不然什么assay都白搭。一些
: 比较fancy的next-gen sequencing方法在detect low level of breaks方面也很
| m********o
发帖数: 98 | 9 认识的同学发的，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4338291/
response
【在 r**********e 的大作中提到】
: 很感激。
: 的确我不知道locus of interest到底是什么damage，我totally外行
: 我是ChIP data发现这个repeats：
: 有H3K56ac的enrichment，同时也是BrdU enrichment的地方
: BrdU意味着active DNA replication？而H3k56ac也是replication和damage response
: 相关
: 所以读了一堆文献，感觉经常看到的就是MMS可以induce DSB所以就先用MMS来下手（说
: 错了请指正）。敢问内行们，如果你们看到BrdU和H3K56ac这样的marker，会接着怎么
: 做呢
: thx
| F******p
发帖数: 2099 | 10 做致病基因，用DNA repair领域的model, 你想清楚自己的rational了吗？ |
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