l**********1
发帖数: 5204 | 1 LZ 用工作邮箱发询价电子邮件
到
//www.microscopyu.com/contact.html
//www.microscopyu.com/articles/superresolution/stormintro.html
就问以下的这款 配置 Total Package one unit how much USD? ( including tax)
Nikon TI TIRF/STORM/PALM
Primary tasks:
Single Molecule Fluorescence Microscopy
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
Super-resolution Microscopy (PALM, STORM)
Scanning Stage Microscopy
Microscope: Nikon Eclipse Ti with Perfect Focus System
Objectives:
Nikon Apo TIRF 100x N.A. 1.49 oil
Nikon Plan Fluor 40... 阅读全帖 |
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w********r
发帖数: 1431 | 2 你的实验可以用PFA固定么？
我之前用PFA处理细胞，加入PFA之后在显微镜下看，可以很清楚的看到GFP的信号就没
有了，
但是去掉PFA之后用PBS泡着，慢慢的GFP的信号就又恢复了，
挺好玩的，就像关灯开灯一样 |
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e****p
发帖数: 354 | 3 刚开始做IF, DABI GFP RFP都染了，结果发现GFP negative control还较强,确定没有
加一抗，加了一抗的更强， 请问是否有遇到过这种情况，不知道有什么解决方法。。
。 |
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e****p
发帖数: 354 | 4 刚开始做IF, DABI GFP RFP都染了，结果发现GFP negative control还较强,确定没有
加一抗，加了一抗的更强， 请问是否有遇到过这种情况，不知道有什么解决方法。。
。 |
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a******1
发帖数: 116 | 5 我转染了eGFP-actin 到HL60细胞系，在荧光下观察转染效率大概是40％－50％，用
western检测的时候：GFP的抗体可以在70kD左右检测到GFP-actin的条带；但是actin的
抗体没有70kD的条带，只有自身的43KD的条带； 请问有人碰到过类似的情况么？有什
么解决方法呀？多谢
另，已换了两个公司的actin的抗体，都只得到一条带 |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 很正常。
我从来还没有见过哪个actin 抗体能够识别 GFP-actin的。 我的猜想是因为
GFP 是一个很难打开的球形蛋白，所以会挡住很多抗体。
另外，actin 的N和C端距离得不远（球形蛋白）。 |
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w***a
发帖数: 1053 | 7 我觉得可以检测的到
如果抗体识别位点离gfp不是很近的话
你可以western的时候曝光时间长一些,看看能不能看到gfp-actin条带 |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 如果你一定要做的话，可以用GFP抗体把 GFP-actin 拉下来，然后用anti-actin 把
actin 拉下来，然后跑胶对比 |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 如果你一定要做的话，可以用GFP抗体把 GFP-actin 拉下来，然后用anti-actin 把
actin 拉下来，然后跑胶对比 |
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a******1
发帖数: 116 | 10 这个想法值得一试，哈哈，多谢；
本来想的是同时用不同浓度的actin和GFP蛋白来做一个梯度，再加上我的samples，分
别用anti-actin和anti-GFP,最后婉转的得出个比值。。。 |
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S******9
发帖数: 2837 | 11 最近做GFP和MAP2的double stainning。因为都是rabbit来源的，所以先做的GFP的
staining，然后做MAP2的staining， 总是做不出来， MAP2 抗体来源是cell signal。
今天做HA和MAP2， HA和GFAP的双染， 后者不错，前者出不来MAP2
所以请教大家MAP2有没有好的抗体推荐? 做脑组织染色用的。
谢谢 |
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r****r
发帖数: 36 | 12 1. in 293 cells
1.1 not expressing anything
1.2 express GFP
1.3 express IL17-RA
1.4 express IL17-RE
2. Treat IL17C on cells of "1".
2.1 Treated IL17C-->Bold Line.
2.2 Not treated with IL17C -->Shaded area
3. Detect IL17C by FLAG antibody in IL17C treated or not treated cells in "1"
4. If IL17C binds to cells in 1, you'll see stronger signal (bold line) than
non-treated control (shaded area).
5. Because IL17C binds to IL17-RA and IL17-RE, you can see the bold lines
shifting right in c... 阅读全帖 |
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G*****m
发帖数: 198 | 13 我的意思是wt已经能做不少事情，后人对ChR2的改造并不能和GFP改造的重要性相比
GFP不改造真的用不了
pulse
面。 |
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q**********0
发帖数: 335 | 14 Recently, I transfected pmaxGFP plasmid to HepG2 cells by using
Lipofectamine2000 to track the positive-transfected cells with another test
plasmid. However, the FACS result showed no separation between GFP positive
or negative cells, only one cell population. I don't know whether the
transfection efficiency is too high that almost every cell was transfected?
or pmaxGFP is not a proper GFP plasmid to use in FACS? Your suggestions will
be appreciated. |
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c********b
发帖数: 363 | 15 你刚才问HA抗体没带，怎么确定是HA或FLAG才有表达？
pGWB的载体需要测序的，在我手上假阳性很高。我一般喜欢用pearleygate系列的。
另外你说GFP连上去不表达，是瞬时表达还是转基因？我最近发现即使是
agroinfiltration也是很多讲究的，除非是GFP或者GUS，其他蛋白都需要摸条件。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 16 请问有没有转基因鼠，有GFP之类的marker，特异在线粒体
中定位的，看到jackson lab有个YFP的，但是还不available，
不是这个领域的，不知道有没有更好的，公认的GFP标记的老鼠。 |
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n********y
发帖数: 187 | 17 NOTHING is easy ---
1. 要是正统生物以外的事情就是"就是一拍脑门的事",
2. "后面的fine-tuning的技术细节，对project的成败已经无足轻重"
these are too simple & naive stereotypes.
如果是这样,那么GFP的NB奖应该给那个在CAR DEALER开通勤车的---除非你说GFP是正统
生物.
我从来没有说这CONTRIBUTION这样写不应该,因此非常同意你说的---
" 我觉得这件事上当事人做的都没有问题，明确的注明了contribution,
并且认为,这后面的工作更多,更重要,而且还没完呢.
但是这原始创新点子的所有人应该不是ZXW. |
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t****r
发帖数: 66 | 18 当事人没那么计较。
没人会因为不是ZXW conceive的，就觉得ZXW不牛，她在这个方向上做了重要的连续的
工作。
就像虽然不是roger tsien第一个克隆的GFP，但这一点不影响他在GFP领域的地位。
而因为注明了MR conceive的idea，大家也都知道了MR的贡献。这是双赢呀。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 19 这个建议可以试试。
挑了单克隆你会发现，GFP表达少的细胞长的好。表达很高的很难活下来，所以另外一种
原因是GFP毒性。 |
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d****e
发帖数: 13 | 20 What is this? I transfected Hela cells with p27 fused to GFP by calcium
phosphate method. The GFP fluorescence localized to nuclei but there a few
bright spots in the nuclei corresponding to the bubbles under bright fields.
Is this normal? are those spots auto fluorescent? |
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c********r
发帖数: 1125 | 21
是阿，现在都流行搞全球游说得，包括原来GFP 得marty Chalfie，实际他的贡献不是
最大的（GFP 既不是他发现得，也不是他克隆得，他只是做了第一个转基因而已，要是
这都可以得，干细胞奖发都发不完。。。），但是他差不多得奖几年前就开始在讲座里
宣传自己的credit，包括原始实验纪录和照片啥得。。。精明得很。
下面我认为肯定有戏得是Gary Ruvkun和Victor Ambros。 |
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C***2
发帖数: 62 | 22 Thank you for your reply.
The locus i knockin Cre is expressed in ES with low level. PI want to make
sure whether the inserted Cre work functionally or not before blastocyst
injection.
I recalled that i ever electrotransfer pEGFPN3 to ES, indeed i observed
sporadic GFP. So, i decide to use CMV-Loxp-gfp-Loxp to confirm the
construction.
I feel shame on the third point, how can i make this type of mistakes.
body
Addgene
have
within
in |
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p******b
发帖数: 379 | 23 谢谢大家了， 这么热情的帮忙，
关于promoter， 大家认为是用同一种promoter， 还是两个不同的promoter好呢？
我目前倾向于两个不同的promoter （UBC 和CAG）分别表达GFP和mCHERRY, 但是如果用
同一种promoter的话，GFP和mCHERRY的表达水平会更接近，更利于比较，不过听说用同
一种promoter的话，质粒本身会有重组， 所以很纠结是用同一promoter还是两个
promoter
还有关于polyA的，也是相同的问题， 是不是得用两个不同的polyA会好一些呢？
真心感谢! |
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f*********r
发帖数: 1233 | 24 总体来说，licor odyssey还是不错的。荧光二抗不是问题。300块100ul可用几个月一
年。
好处是大大节约了步骤和时间。不需要底物反应和底片曝光。
最大的好处，上面都没有提到。licor可以同时识别两个波长的荧光。假设你需要计算
蛋白X的磷酸化比例。你可以在同一张膜上同时孵育两种抗体：总x，磷酸化x。当然，
这两种抗体必须来自两种动物（比如小鼠和兔）。然后同时孵育两种二抗。这两种二抗
要连接不同荧光，一个波长680（红），另一个800（绿）。
扫膜将同时显示红绿两种颜色。定量时划一个框，软件会显示框中红绿荧光两个值。两
者的比值真实反映磷酸化比例。任何其他单色wb定量算出的比值都是估算值。
不仅如此，licor扫描出来的彩色条带还可以从视觉上很直观地显示磷酸化比例。假设
磷酸化x标记为红，总x标记为绿，那么磷酸化高的条带偏红，磷酸化低就偏绿，磷酸化
水平适中就显示黄色（软件自动设定红绿叠加结果为黄）。发文章的时候，视觉上比显
示两遍黑疙瘩（一个是总x，另一个是磷酸化x）好。
另外，此设备对gfp的荧光敏感，凡是gfp需要定量的样品，包括细胞培养皿，甚至小鼠
（或其器官）都可... 阅读全帖 |
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d*****8
发帖数: 29 | 25 现在没control很难开始。 我们在干细胞里表达GFP， 然后可以用FACS sorting 出GFP
＋ cell。 但是这个population 总会有点污染。而且做Chip 的material 估计不够，
所以我们打算用组织做。 |
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d*****8
发帖数: 29 | 26 现在没control很难开始。 我们在干细胞里表达GFP， 然后可以用FACS sorting 出GFP
＋ cell。 但是这个population 总会有点污染。而且做Chip 的material 估计不够，
所以我们打算用组织做。 |
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w******e
发帖数: 42 | 27 另一个危害就是data模糊外加选择性解读，最近的一个真事：
ucsd jin yishi lab 2009年的cell paper (汗，一座还是个中国人）；这个工作后面
有两个postdoc 和一个graduate分别开展不同方向的研究。几年来都米有进展（害人呀
！）。都发现以前的结果很难清晰再现（至少不象发表的那么黑白分明）。有一个苦逼
薄厚花了一年多时间仔细重复，还是不行。最后把一座嫩回来再重复。结论是当初用的
DsRed有非特异性，换成gfp后就没有任何区别了。当初结论完全不支持！
据说jin yishi很 “严肃” 的结论就是以后要用 gfp! 不知对这个cell paper, 这个
结论有没有后话了！ 呵呵。
老圃的话，看来还是 老虎，苍蝇还是要一起打。你说老板心里不明白吗？ |
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m*****p
发帖数: 8 | 28 以我有限的智商判断这大概是在说我的文章。本来不想回的，可是记得几天前的一个帖
子似乎也提到了类似的事情。
关于那片文章，不管gfp还是mcherry结论是一样的。唯一的区别是mcherry可能引起的
dimmer或者其他的原因会引起synapse位置蛋白增多。在gfp的情况下大部分蛋白在细胞
核或核附近，小部分在synaspe和axon。
另外我只知道有一个postdoc。和一个研究生在做继续的课题 （一个很漂亮的韩国姐姐
，和很漂亮的美国妹妹。）。 关于这些试验的细节我在组会上已经说的很清楚了。我
跟韩国姐姐一起做了一些试验，她有一些新的发现，是在原有的现象上有一些新的发现
，具体是什么就不说了。。。那个研究生的课题，据我所知很顺利。
可能因为我是神经所毕业的，大概这也是为什么会被在这个帖子里提起。所以我还要废
话几句。
关于poo。 从我个人来说，我非常感谢poo。我记得我还是研究生的时候，poo参加了我
们几乎所有人的每一次的年度审核，给我们专门讲解如何读论文和写论文，几乎帮助所
有人做过一对一的几乎逐字逐句的改写manscript。我还没有到可以评价poo对科学界或
中国科学贡... 阅读全帖 |
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w******e
发帖数: 42 | 29 靠，本意是讨论ethnics，乱枪射出的”房妹“来
就事论事，在老poo的严谨下，你这data能是一样的吗？
》》
关于那片文章，不管gfp还是mcherry结论是一样的。唯一的区别是mcherry可能引起的
dimmer或者其他的原因会引起synapse位置蛋白增多。在gfp的情况下大部分蛋白在细胞
核或核附近，小部分在synaspe和axon。
》》
这个pattern 都shift了八？姐，不带这样的？
你包老poo和老jin的大腿，夸他们严谨，就是为了反衬你自己。可你这也太离谱了？ |
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q****n
发帖数: 8 | 30 【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
发信人: qitian (齐天大圣), 信区: SanDiego
标 题: Re: 中科院神经所2012年年会蒲慕明所长的讲话 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jan 28 13:03:09 2013, 美东)
发信人: wonewbee (wo newbee), 信区: Biology
标 题: Re: 中科院神经所2012年年会蒲慕明所长的讲话
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jan 24 12:27:24 2013, 美东)
另一个危害就是data模糊外加选择性解读，最近的一个真事：
ucsd jin yishi lab 2009年的cell paper (汗，一座还是个中国人）；这个工作后面
有两个postdoc 和一个graduate分别开展不同方向的研究。几年来都米有进展（害人呀
！）。都发现以前的结果很难清晰再现（至少不象发表的那么黑白分明）。有一个苦逼
薄厚花了一年多时间仔细重复，还是不行。最后把一座嫩回来再重复。结论是当初用的
DsRed有非特异性，换成gfp后就没有任何区别了。当初结论完... 阅读全帖 |
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z*t
发帖数: 863 | 31 问个问题哈，talen切割后不是通过引入的片段同源重组来edit genome么？
楼主若是相加个gfp在同时转针对特定序列的taln + 两侧用同源片段flank的GFP
plasimid就可以了？ |
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z*t
发帖数: 863 | 32 问个问题哈，talen切割后不是通过引入的片段同源重组来edit genome么？
楼主若是相加个gfp在同时转针对特定序列的taln + 两侧用同源片段flank的GFP
plasimid就可以了？ |
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L*********x
发帖数: 2191 | 33 我一直没明白到底是记录Ca/K离子的运动算是信号传递，还是记录细胞膜电压的变化算
是信号传递。
做离子GFP的发一堆水，做电压GFP的又是一堆水，而这两堆水从来不管对方的事。 |
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b******y
发帖数: 627 | 34 I am over-expressing GFP-tagged protein in 293T cell and planning to IP
using anti-GFP antibody to see what interaction partners are pulled down.
Anyone can suggest the appropriate detergents and their concentrations for
breaking the cell while not interfering with protein-protein interactions?
Thanks a lot! |
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l**********1
发帖数: 5204 | 35 CA630 1%
Immunoprecipitation of IMC components. Highly synchronized late-stage
parasites were purified over 70% (wt/vol) Percoll, and proteins were
extracted by
incubating them on ice for 15 min in RIPA buffer (1%
octylphenoxypolyethoxyethanol
[IGEPAL CA-630], 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate
[DOC], 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS], 50 mM Tris, pH 7.4). Soluble and
insoluble fractions were separated by centrifugation at 12,000 g for 10
min at
4°C. Soluble lysates were incubated for 1 h... 阅读全帖 |
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G*****m
发帖数: 198 | 36 in zebrafish, some cells will happen. lox-DsRed-lox-GFP will become lox-GFP.
don't know why. |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 谢谢大家给了那么多的好建议！我一开始就想动手去改那个pGIPZ 里面的MCS site
的。其实即使不用改，在那个XhoI - EcoRI 旁边就有一个BamHI。所以我非常疑惑那个
公司为什么放着这么简单的方法不用而非要那么麻烦的在不同的质粒之间倒腾。但是听
起来貌似是他们的shRNA 很就以前就做在pSM2里面了所以就将错就错的啊。
不过上面一个好心的网友和另外一个发私信给我的网友都告诉了我要小心这个CMV
promoter, 这么一听我就有点介意了。因为虽然我主要用的是immortalized 细胞系,但
是偶尔也会整整一些primary cells, blood cells 之类的。如果CMV 有这个问题的话
我就不想在上面投入太多精力了。
我在addgene 上找另外两个网友说的荧光标记的shRNA vector 的时候，非常碰巧的看
到了这个 pLKO.3G, 上面的说明是 pLKO.1-puro 改成的。不知道有没有人用过？ http://www.addgene.org/14748/
如果这个好用的话我可能就用这个了。因为我的好几个其他shRNA construct 都... 阅读全帖 |
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b*********8
发帖数: 44 | 38 我在烟草中做Co-IP， 用 A-HA 钓 B-GFP 。做了一次没有发现GFP信号。 我怀疑我的
蛋白的互做比较弱。请问cross-link如何做？
另外，如果把蛋白浓缩一下会不会效果好点？那个公司的浓缩柱会好点？
谢谢了！ |
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m****M
发帖数: 360 | 39 你的P３肯定在GFP上吧？你用P３和P４扩heterozygous只能扩出一个targeted allele
呀。不可能扩出Wildtype allele呀。用P１做测序引物，前面一点肯定是Wildtype序列
呀（不太确定具体多长，也不确定你具体短到何种程度，看到Exon1了吗？）。我建议
你在GFP后面的序列上设计两个相反的引物进行分别测序 |
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C**S
发帖数: 522 | 40 图片是U2Os GFP－LC3细胞，还没有给予starvation。以这个图为例，有很多问题，一
一求教
1：如何定量。大家用软件还是手动数，软件的话有什么软件推荐？
2：还是定量问题：看到说autophagosome大小在0.5－1.5uM，照片上的很多小点是小于
这一值的，是不是只数大于0.5uM的？
3： 怎么解决heterogeneity的问题。看autophagy文章error bar都很小。怎么培养细
胞才能减少对照细胞的autophagy？ 同样的问题在starve之后也存在。
4：细胞在EBSS里starve6小时，也没看见GFP puncta明显增加，是不是有什么没有注意
到的问题？还是在这个荧光定量的实验中，大家都是默认加inhibitor的比如bafA1，即
使实验方法中没有明确说明？
预先感谢大家能够一一解答。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 41 GFP不能这么用的。这种实验首先要先用immunofluorescence验证你
的GFP融合蛋白确实定位正确，这个不能做直接证据的 |
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t**l
发帖数: 109 | 42 第一个问题是： 这个retroviral 系统会不会导致random integration?
如果有random integration,这个问题是不是已经被忽略了？
第二个问题是： 这个shRNA 是不是永久表达? drug selection gene 需不需要加，如
果有GFP在这个construct里面，能不能FACS出来GFP+ 细胞，是不是就不需要drug
selection gene.
第三个问题： 当初的viral transduction效率有多高？ 在ES细胞上如何。
最后一个问题是： 如果做screen, 这个barcode 当初在做library的时候是不是唯一的。 |
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B******s
发帖数: 3 | 43 最近尝试在鸡胚脊髓电转质粒来表达外源蛋白，用了pcDNA3.1的vector没看到蛋白表达
（CMV promoter，GFP tag），阳性对照用了另一个载体表达GFP看到很强的表达（另一
种promoter），有没有达人知道CMV promoter在鸡胚脊髓电转工作不工作，效率咋样？
多谢您的回复和帮助 |
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D*******D
发帖数: 100 | 44 我的经验adeno是第二天就能看到不错的GFP了，lenti也不是很慢但是GFP上升趋势缓慢
。 |
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C**S
发帖数: 522 | 45 我最近也在装一个载体，把一个5k的基因装到pEGFP－C1载体再把GFP fusion蛋白装到
pBabe retroviral里。酶切测序都对，就是转到293T细胞里只能看到极少数细胞GFP阳
性。真的是因为基因太大了？谢谢。 |
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l******3
发帖数: 25 | 48 您说的是，以前是听说过IRES下游的基因会被抑制，我可能是可以检测一下目的蛋白，
但是如果GFP不表达，就算上游我的目的基因表达了，可能也不行，因为我是想下一步
直接去sorting GFP+的细胞的。
那个基因太大，我要转的特定的细胞又长得太慢，真是麻烦~~
还是谢谢啦~ |
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j******i
发帖数: 939 | 49 transfection 50%太低了 应该有100%的啊 你的transfection可能有问题 有普通的gfp
plasmid对照吗 另外 gfp是必须的吗 如果不是必须就去掉吧 或则用2a连接 |
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f*****f
发帖数: 195 | 50 谢谢。有个疑问，直接放ires-gfp或gfp，基因组序列一下增加了几百bp，不会导致可
变剪切吗？ |
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