j*****a
发帖数: 92 | 1 The insert should be 0.9 kb, which is correct on oagarose gel
electrophoresis analysis. However, after ligation, tranformation. Positive
transformants show plasmid (correct size( and insert (1.5 kb instead 0.9 kb)
. Then we expressed it and do not get the protein. Any suggstion? Thanks |
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b******n
发帖数: 4225 | 2 你的引物得在合成的时候让公司给5'端加磷酸
否则一般的Ligase没法连上
ligation |
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s******s
发帖数: 13035 | 3 一般vector都不用去磷，因为严重影响连接效率。
我宁愿多screen几个colony
ligation |
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C******2
发帖数: 97 | 5
vectors
The construction is modified and derived from pRetrosuper which is used for
random mutation in host genome based on gene-trap. Truncated 3’LTR
fragment is promoter activaty lost. The idea is host genome will be mutated
by insertion because the existence of splicing acceptor(SA) fragment thus
generate a fusion RNA containing cherry CDS. Fusion florescence protein can
be detected in some case when insertion occurs as an in frame manner. The
insertion will also make the infected cells be... 阅读全帖 |
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n****y
发帖数: 819 | 6 请用过的人说一说， 这个酶是不是连接效率很低？ neb的网战上说这个酶 AflII-
generated DNA ends do not ligate well. 如果我要把一个 1k 的insert连到10 k的
vector里面， insert两边都是aflII， 是不是基本没希望？ |
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T**N
发帖数: 129 | 7 效率没觉得明显不同. 感觉和其他酶差不多.
但是你这个两头都是同样的酶...... 那载体self ligation可不好控制. AP TREATMENT
也许能起点作用. |
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q*****d
发帖数: 445 | 8 老板给了一个研究transposon定位的问题，半年多也搞不定，请专家学者们给分析一下：
就是一质粒被线性化之后转化到动物细胞之中进行随机整合，这个整合位点随着分裂会
在同一个位点形成好几百个copy，现在老板想让我把整合位点给找出来。我试了Random
PCR和Digest DNA, ligate with adaptor， PCR，但是这两种方法都没有找到整合位
点，测序结果发现，PCR产物都是来源于转化载体。我也查了一些文献，都说自己的方
法行，但不知道那个方法更实用？因为一个整合位点只有前后两个结合点是需要的信息
，而那个载体本身的copy数却有好几百，所以干扰非常的大。
请牛人们帮忙分析一下！ |
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d****i
发帖数: 2346 | 9 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
。 |
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l******a
发帖数: 3339 | 11 顶礼膜拜一下，幸好你不是我师兄，不然得走多少弯路。
ligation |
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d****i
发帖数: 2346 | 12 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
收回我说的吧。对不起大家了。
我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
再次对大家表示对不起！ |
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d****i
发帖数: 2346 | 13 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
。 |
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l******a
发帖数: 3339 | 15 顶礼膜拜一下，幸好你不是我师兄，不然得走多少弯路。
ligation |
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d****i
发帖数: 2346 | 16 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
收回我说的吧。对不起大家了。
我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
再次对大家表示对不起！ |
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c*****x
发帖数: 83 | 17 【 以下文字转载自 Immigration 讨论区 】
发信人: cookiex (checking。。棉花依旧), 信区: Immigration
标 题: review opportunity 1分多 脾脏病理
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Nov 18 15:53:20 2013, 美东)
一分多杂志，关键字： Hypersplenism ; Ligation of splenic artery ; Partial
splenic embolization ; Case
report。
有兴趣而且专业符合的话，请站内告诉您的E-mail address，Name, Affiliation（单
位），简单cv， research area. 发至站内。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 18 我不是做某个基因的突变
这个subclone，还有sunnyday说的overlapping PCR然后再ligate当然也是可以
另外还有些别的方法绕开
不过都多很多步骤
（在我目前情况下）不是首选
我已经有一批8个同样backbone的质粒，
一个wt，7个mutants，
每一个都是双基因的Dicistronic expression
现在要改变RBS区域的东西
如果QuikChange可行，很快8个就都换好了
不然要从原先的backbone开始折腾起
再重新克隆
虽然我也已经试过用原先没有insert的vector做QuikChange，
也有问题 |
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m******t
发帖数: 109 | 19 sequenced Tvec again. mutation still there.
cut and ligate again. meibanfa |
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e****s
发帖数: 1125 | 21 SmaI可以用XmaI代替，就成Stick end了。
3 way ligation做过不少。4个没弄过。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 22 我还以为都同源呢。你1，3同源，先把1，2连起来不就可以做3 frag ligation了？
我当年做200多nt首尾大量同源的片段，还是order了十条五十多单链DNA，
然后1－6一起连，7-10一起连，最后做的3片段连接 |
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b*****s
发帖数: 169 | 23 这两篇文章乍看起来是矛盾的，其实不矛盾。第一篇文章说的是PD-L1与T细胞上的PD-1
结合导致T细胞凋亡。第二篇文章说的是PD-L1的抗体（其实有点类似于blok PD-L1与PD
-1的ligation）可以促进T细胞上生长。注意一个说的是T细胞上的PD-1对本身T细胞的
影响， 另一个说的是T细胞上的PD-L1对本身T细胞的影响，信号传导途径截然不同啊。
虽然培养T细胞的时候，表达PD-L1的T细胞会抑制表达PD-1的T细胞，表达PD-1的T细胞
会促进表达PD-L1的T细胞的生长，综合的T细胞生长是一个平衡的结果。
member |
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w**********k
发帖数: 386 | 24 你不是在公司工作吗？ topo cloning 这点钱是毛毛雨啊。
要不老纳给你推荐 isothermal ligation, 用了多说好。 算+能量吧 |
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O********4
发帖数: 113 | 25 看来你不常做分子生物学。RT的产物不需要nick repair 或ligation啊，就像通常做就
可以了。RT 的产物是linear DNA的，只不过跨过circRNA特有的splice Junction. 比
如你用一个基因里反向的引物做PCR， linear mRNA 就没产物，而circular RNA 才会
有产物， 再一测序发现你的产物上exon 4连到exon 3 的5' end 了，这就证明了是环
状。
<- ->
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
还有你可以用外切酶RNase R 处理一下，线性的RNA被降解而环状不降解。
最早发现circRNA 的是通过90年代开始大规模测EST （那时还没有RNA-seq ) ， 发现
许多mRNA 的exon order 反了, 这不是由于trans-splicing 就是由于 back splicing
，结果这两种splicing方式都存在。还有circRNA 是可以被翻译成protein 的，所以也
不能说它纯粹是非编码，呵呵。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 26 How about ligation mediated PCR? Oldie but goodie. |
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e****l
发帖数: 115 | 27 http://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(15)00046-X/abstract
Journal of Molecular Diagnostics
May 2015 Volume 17, Issue 3, Pages 273–283
Accurate Classification of Germinal Center B-Cell–Like/Activated B-Cell–
Like Diffuse Large B-Cell Lymphoma Using a Simple and Rapid Reverse
Transcriptase–Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Assay
A CALYM Study
Please send to [email protected]
/* */
Thanks so much!! |
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m*********D
发帖数: 1727 | 28 这要看是什么级别的成功和失败了。一个project，你是对的；一个实验的流程，我说
的没错。
记得刚学做cloning，作一个blunt-end ligation，把PCR产物连到一个vector里。
vector/smaI切后，de-phosph，没连进去。坐下来生了三个小时的闷气，知道错在那里
了。和另一个老博士后一说，她说三小时？以前一个student，三个月没想出来，后来
放弃了。 |
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f******g
发帖数: 1003 | 29 没有调查就没有发言权，下面是齐海独立后5年以通讯作者发表的文章，研究性论文三
篇，two nature，one Journal of Immunology,在美国顶级研究所也说得过去把.
Dan Liu*, Heping Xu*, Changming Shih, Zurong Wan, Xiaopeng Ma, Weiwei Ma,
Dan Luo, and Hai Qi#. T-B cell entanglements and ICOSL-driven feed-forward
regulation of germinal centre reaction. Nature, 2014 (Oct 15, Epub ahead of
print, doi:10.1038/nature13803).
Coco Chu, Yifeng Wang, Xu Zhang, Xinya Ni, Junxia Cao, Wan Xu, Zhongjun Dong
, Pengfei Yuan, Wensheng Wei, Yuanwu Ma, Lianfeng Zhang, Longyan Wu, an... 阅读全帖 |
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x********e
发帖数: 35261 | 30 8k以上我胶回收和ligation都有问题，看来必须上recombineering了。谢谢 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 31 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
低点，3-5度。
genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
就够用20-50次PCR了。
我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
可以用两个不同的酶来克隆。Sal I是老鼠和人genome里少见的酶位点，我几乎每次都
能用上。其他的看运气，识别8 ... 阅读全帖 |
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j****n
发帖数: 3370 | 32 赞纯技术帖 现在很难找到这种老熟练工了 毕竟新方法更能解决多片段大片段克隆 但
同时也忽视了一些最基本的training
这个和miniprep 类似，新学生应该没几个知道buffer 1/2/3啥成分了
现在实验室 估计两片段ligation都没多少人愿意挑战了
Taq
well
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.4 |
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n*********e
发帖数: 180 | 33 你这个问题问得非常好。这个bacterial colony只能take一种质粒纯粹是分子克隆作者
的谣传。
根本就不是这么回事。我原来做recombineering的时候需要将一个质粒的一部分切掉形
成一个新的质粒。但是因为不是每个质粒都被切，最后拿到的是一个混合物。由于两个
质粒都特别大，相差的片段也很短，没法通过跑胶分开。所以我就想到了这个质粒不相
容原理。结果试了一下完全是bull shit。无论怎么反复稀释transformation拿新的
colony，发现这两个质粒都在一起。最后只好把质粒切成片段，回收重新ligate才解决
这个问题。 |
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H****N
发帖数: 997 | 34 This actually has to do with formation of plamid concatemers. Re-
transformation does not always solve the problem. You can simply linearize (
monomerize), re-ligate, and re-transform to separate them. |
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m*****n
发帖数: 760 | 35 请教这个USER cloning相比常规的RE/ligation cloning有什么特别的优势？ |
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s********r
发帖数: 312 | 36 Use DNA concentration kit to purify your PCR product, elute in 45ul of H2O,
check concentration. Then cut PCR product for 3 hours, gel purify, ligate
and transform. |
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x********e
发帖数: 35261 | 37 PCR之后TA ligation
如果这都不成功就要考虑片段是否有毒性了
呢？ |
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N*********6
发帖数: 2302 | 38 人在国内，有11篇文章。有兴趣的PI, 请email me ：：[email protected]
/* */
谢谢！
1. Kang H, Cao S, Chen T, Jiang Z, Liu Z, Li Z, Xu Q, Lin Q, WeiS. The poor
recovery of neuromyelitis optica spectrum disorder is associated with a
lower level of CXCL12 in the human brain. J Neuroimm, 289:56-61, 2015.(co-
first author)
2. Chen T, Li Z, Jiang Z, Liu Z, Xu Q, Huang D, Lin Q, Wei.S (2015) Changes
of CXCL12, CXCL14 and PDGF levels in the brain of patients with idiopathic
demyelinating optic neuritis and neuromyeliti... 阅读全帖 |
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t********9
发帖数: 536 | 39 请教大家在做Clone的时候， 做完Ligation之后，要先走胶检查是否Insert和Vector连
起来了吗，还是直接做Transformation，之后挑单Clone，摇菌，提取Plasmid，测序？
多谢！ |
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e****s
发帖数: 1125 | 40 Ligation以后量那么少。
一般是Transformation，提取Plasmid后，做个Digestion test，跑胶。然后测序。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 我以前试验过好几种方法，包括我说的那个RNA ligation 的高大上方法，后来发现最
简单最有效的方法就是经典方法：
第一步. 用OligoDT做primer来合成cDNA
我推荐 SuperScript First-Strand Synthesis System
第二步.用基因特异的primer来克隆感兴趣的基因，注意引物要离基因的编码区的
开头(ATG)和结尾(Stop codon)至少有20bp距离（下面我会说原因）。如果基因
的GC含量高，可以用Herculase来做PCR, 不然的话我一般都直接用heat-activated Pfu
turbo.这样非特异带少。
第三步。如果上一步克隆得到的带太多，或者得到一个smear, 那么就再把得到的
产物简单过小柱子纯化后直接用nested primer重新再扩增一次，这样一般都可以
得到一个非常纯的条带。
Nested primer设计的时候必须在上一步用的引物的内侧（这个就是为什么第2步的引物
我告诉你说离开头和结尾有至少20bp距离,就是为了给Nested primer预留地方的）。
primer? |
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g*****n
发帖数: 250 | 42 你认为那两个蛋白应该在哪种细胞里相互作用，就用那种细胞。co-ip 和 PLA (
proximity ligation assay)可能是快捷的方法。也可以在含有那种细胞的组织上做PLA
。 |
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D***a
发帖数: 516 | 43 我觉得proximity ligation assay检测共定位真是一个靠不住的实验，无论什么两个蛋
白，或多或少总会有阳性信号。只是一个锦上添花的结果，不能一锤定音。 |
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z*t
发帖数: 863 | 44 你这个类似的idea我也想过，后来没有exactly试过。说几句吧。
楼上有人提到的In vivo ligation我也试过，但是我的经验吧在HDR高的系统里（比如
老鼠胚胎）就是ssDON介导的HDR也非常有效。在我的细胞里（血液细胞）无论怎么搞
HDR就是看不见...
HDR提高效率公司里的人说最好用targeting vector。另外一点不利于这个idea（做模
型）的是现在dCas9-AID potential的效率和建议程度比HDR要高 |
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发帖数: 1 | 45 想听听各位大神们的高见。
单细胞甲基化、单细胞ChIPseq是不是最有前景。但是也不是一般的实验室有条件做的。
最近看到一篇文章，用免疫荧光检测单细胞的特定基因组loci的组蛋白修饰。
原理很简单，就是结合原位DNA－ISH和PLA （proximity ligation assay）。组蛋白修
饰的抗体和一个特定基因启动子的biotin标记的DNA探针，如果结合的足够近（<40nm）
，用PLA标记的二抗可以检测到发光。
所需要的reagent大部分实验室应该都有，只需要去sigma买一个PLA二抗kit，克隆目的
基因的区域，用nick translation做一个生物素标记的探针。实验方法就是细胞染色，
不需要什么高超的实验技巧。
这个实验的好处是单细胞，观察特定的组织／细胞群，可能会得出跟ChIP－qPCR不同的
结论。缺点是不能定量、高通量。 |
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y*********u
发帖数: 183 | 46 最好要size selection
对判断peak summit也有帮助
Chip-Seq和RNA-Seq analyzing principle不一样，没分析过的人下意识地以为size
selection会损坏信息的保真度，其实selection后信息保真度更高。
你shear完的size和chip后的size以及最后effective建库的size根本不是一回事
最科学的做法是adaptor ligation完做size selection再library amplify |
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发帖数: 1 | 47 你说的很对，recommended的protocol都是size selection。但是我们的facility坚持
认为没必要，他不size selection，测序前library跑的bioanalyzer是个100bp到1kb的
宽峰…
怎么说服他做size selection？
话说为什么size selection 保真度更高？
[在 yiersanmumu (一二三木木) 的大作中提到：]
:最好要size selection
:对判断peak summit也有帮助
:Chip-Seq和RNA-Seq analyzing principle不一样，没分析过的人下意识地以为size
:selection会损坏信息的保真度，其实selection后信息保真度更高。
:你shear完的size和chip后的size以及最后effective建库的size根本不是一回事
:最科学的做法是adaptor ligation完做size selection再library amplify |
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w***o
发帖数: 151 | 48 We can add a 5'-PO4-DNA (Single Stranded) to the 3'-end of a ssRNA using T4
RNA ligase I, but cannot add a 5'-PO4-RNA (single Stranded) to 3'-end of
ssDNA.
Highly appreciated any suggestion on how to add a ssRNA to a ssDNA. Thanks a
lot |
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w***o
发帖数: 151 | 49 We need add 5'-PO4-RNA to 3'-end of ssDNA
Not adding DNA/RNA to ssRNA |
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w***o
发帖数: 151 | 50 We tried it, didnot work |
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