T*****n
发帖数: 897 | 1 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: Tonyvan (Tony), 信区: Biology
标 题: microarray及real time PCR发现了一些基因表达降低,但却不能用WB及ELISA证明怎么办？
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 23 21:00:10 2012, 美东)
我们做microarray发现了一些基因表达降低，随后用real time PCR 也得到确认。但我
们试图用western blot及ELISA的方法去证明蛋白表达也降低时却遇到麻烦，因为
western和ELISA显示蛋白表达正常。有点想不通。大家遇到过这样的情况吗？ |
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m*******l
发帖数: 12782 | 2 ☆─────────────────────────────────────☆
liverpoo (kkk) 于 (Fri May 24 15:10:14 2013, 美东) 提到:
本人潜水已久，最近这个版如其他id指出的那样，快变成水版菌斑了。唯一和那些版的
区别在于一两个人和一群人的矛盾。meask常常打着提供反面意见的幌子去搅和一个个
别人很有兴致的讨论，我看大家不痛打是没有道理的。鲁迅先生讲过这个故事：一户人
家生了一个男孩，合家欢欣鼓舞。满月的时候，抱出来给客人看，自然是想得一点好兆
头。“一个说：‘这孩子将来要发财的。’他于是得到一番感谢。“一个说：‘这孩子
将来是要死的。’他于是得到一顿大家合力的痛打。有些负面的东西不用你讲出，来这
个版上的大多成人，心中都会明白任何事情都有risks包括CIR。
任何一个版面设立的目的应该是对人有所帮助，给人以希望，很多讨论也许本质就是大
家焦急等待期间的相互宽慰。但meask的问题在于别人发任何利好的消息，他总会去
search反面的消息去反驳，这无异于soft的挑衅，遭到合力的痛打也是正常的。版主看
看帖子list一大堆... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 3 争论是好事，但是部分争论偏离了主题。除了表明你立场坚定，善于争辩外，目前看不
出其中的意义。
要是有媒体报道本版的讨论，那到是个大好事。EB本来就是鸡肋，媒体都懒得说，说完
非法，有的带一句，有的根本就不提。希望通过大家的讨论能够找出表达EB想法的通道。
已经有同学提出不错的想发，大家应该参与其中。把EB的想法传达出去很重要。对于那
些质疑有效性的同学，没有人知道那种方式有效，没有人知道能否影响立法。表达诉求
很重要，结果是什么，无法预知。不表达，谁知道你想要什么。如果你不赞成部分人的
立场，找些志同的，也可以表达吗。（不包括在本版盖楼）没有说大家非要一至。希望
我们能找出这样的通道，出钱出力都可以。印度比我们做的好太多了。
至于是打分还是不打分，怎么打分。观点之争，不要拉仇恨，也没有必要上升到华人如
何的地步。
你只代表你自己，不要轻易代表任何人。也不要义正言辞的说那种制度会使大部分受益
。
那些反对你观点人，显然不是你说的大部分人。大家都是从自己的利益的出发，不要绑
架别人的利益。
好像不同意，就对不起在等绿卡的同胞一样。
大部分同学都在美国奋斗多年，拖家带口。那个不想早拿卡。
希... 阅读全帖 |
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r****s
发帖数: 201 | 4 在新泽西附近的同学们，
哪位可以帮我扩增表达3个pichia strains?
目前我有在甘油里面保存的pichia，里面有我要的质粒， 从外地寄过来的，我没有表
达yeast的环境
需要找个附近的实验室扩增表达，每个细胞系需要在500毫升的摇瓶里面诱导表达。
如果结果好，可能要做大量表达。
如果有能够帮忙的同学，请跟我联系，有报酬。
谢谢了先 |
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c*********r
发帖数: 2097 | 5 前几天的热帖 “真的不建议跟 xxx 学琴” 里面， 很多回帖提到了朗朗的谈吐。有人说朗朗是暴发户，素质低
其实我发现有不少钢琴家，口头表达有问题。不只是朗朗一个人。 前几年听过
Horowitz 的现场访谈，老头子说话的时候，旁边几个人听了完全不知所云， 只能尴尬的笑笑。 前一阵子 KTSF 访问了一个台湾的钢琴天才，说话也是前言不搭后语，没有逻辑。 除此之外还有不少这样的例子。 如果根据朗朗的谈吐判断他是素质低，那么其他这些音乐家是不是也都素质低？未必吧。
什么原因呢？ 我觉得这些人对外界的主要表达方式已经变成以音乐为主了，长期习惯用音乐表达，语言功能就退化了。既然他们的主要表达方式跟常人不一样，我们就不应该用常人的准则去衡量他们。朗朗可能也是这么个情况。 说朗朗是暴发户，素质低，这样的评价可能有些不公。
欢迎讨论。 |
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b******e
发帖数: 2225 | 6 第5名 双子座
表达爱意像是开玩笑，显不出真心，爱意表现在配合度上，不在言语上。一般人都以为
双子座很能言善道，不过其实他的能言善道，是展现在开玩笑上，开玩笑是他的专长。
妳问他爱不爱妳，他讲得一副天花乱坠，乱讲一通的样子，
听起来一点都不像真心话。他会这样是因为他害羞，如果妳真的非要他讲不可，他很清
楚场面不能冷掉，可是他又讲不出来，只好乱讲一通。他爱妳是表现在他的配合度跟顺
从上，妳要他干嘛就干嘛，而不是用嘴巴讲的。
第4名 天秤座
展现诚恳态度就是爱妳的最高原则，不谙胡言称赞，认为实际表现才重要。天秤座擅长
的是表现他的诚恳，他认为他就是很诚恳诚实地对待妳，这就是他爱妳的表现。他很清
楚好听话都是讲给外面的人听的，那是虚伪的。他心里知道妳要他称赞妳，但是他想告
诉妳的是，妳不需要这些称赞，妳还是他最在乎的人。这是他心里想的，所以他1句话
都说不出来，他认为应该讲实话跟诚恳才对妳有帮助，他感觉不想讲就是不想讲，别逼
迫他。
第3名 金牛座
什么都表达不出来，不会当面称赞，但是爱意都会表现在实际行动上。不要说爱意了，
金牛座什么都表达不出来，他向妳表达他最高爱意的方式，是他会称赞妳， |
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w***s
发帖数: 4394 | 7 正如我常说的，音乐不是声音，而是人对声音的一种心理感觉。
而语言其实也不是声音，语言是一种意识的表达，而这种表达
要借助一些约定俗成的词义。要用这些约定俗成的词义作为
媒介，表达一种或几种感觉。我们可以看到其中的难度。
首先每个人对同一音乐作品的感觉都会不同，因为人对音乐的
感觉和自己过去的音乐欣赏经历有直接的关系。其次，对于那些
词汇的词意，对于每个人的理解来说，也并不是非常非常的准确无误
。
第三，也是最困难的一点，人的感情太过丰富，以至于语言非常
难直接来描述。所以一般语言来描述音乐的时候，往往不是直接
描述感受本身，而是借助相似的感受，比如视觉上的，触觉上的，
比如：“就象阳光穿透清晨的一缕薄雾。”这样的方式来表达。
所以用语言描绘音乐，只有极为特殊的情况下才会比较成功，
一般都是非常模糊、不确定的，只能对音乐本身提供一些最最基
本的概念性的信息。
我们可以试着用语言描绘肖邦的钢琴音乐，然后再描绘德彪西的
钢琴音乐，然后再描绘贝多芬的月光第一乐章。我们会发现，这些
钢琴曲是那么的不同，而语言根本不能描绘出它们之间的区别。 |
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w***s
发帖数: 7132 | 8 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: walks (declaw是砍手指，不是剪指甲), 信区: Joke
标 题: 转载-老美突然问了我句：你们中文里关于做爱，有多少种表达方法？
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 26 00:03:41 2010, 美东)
那天老美突然问了我句：你们中文里关于做爱，有多少种表达方法？
来一则，发生在我和另外一名美国留学生之间。当时他们都已经被诸如“戊、戌、
戍、戎、戒”或者“己、已、巳”这样的汉字给折腾得快疯了，我很得意，经常有
意无意就在他们面前夸耀中文的博大精深。结果有一天，这老美终于忍不住了
那天我又跟他们说起中文里关于“妻子”有多少种说法，“吃饭”又有多少种说法，
如此等等。说着说着，这老美突然问了我一句：“K，你们中文里关于做爱，
有多少种表达方法？”
我听他这么问，也没想许多，就拿出张纸来开始给他写，穷举了从文雅的
云雨交媾到粗俗的XX（注，此为屏蔽）等大概三十来种中文里关于做爱的
表达方式，完了把纸递给他，心想：你小子这下得服气了吧？
孰料那老美接过纸后扫了一眼，淡淡说道：“K，我们英语里关于做爱的表
达方 |
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P****e
发帖数: 389 | 9 来自主题: LeisureTime版 - 表达的欲望 恩，横木的文章有些观点和例子我很同意，有些觉得值得商榷。
举王家卫的例子，王的电影里我最喜欢的是他早年拍的《阿飞正传》。这部片是充斥着
表达的欲望和points的。表达了什么？一言以蔽之，就是隔离和孤独。表达得入木三分
。而王后期的电影，花样年华、重庆森林，我都远没有这么喜欢。诚如你所说，《阿
飞正传》是王最清涩的作品。当然王家卫有些小处还是能很真实地触动我的。比如《蓝
莓之夜》虽然做作，但三个故事里酗酒老警察的那个故事锋利而又真实，很有力量。另
一个例外是他的《春光乍泄》，鲜明刻画迷惘的钝痛，绝不是艺术生命孱弱的作品。
关于钱钟书，凉薄与卖弄，cannot agree more. 我记得徐晋如在讲诗词的时候提到钱
的律诗与文风如出一辙，也有类似的批判。
另外，古典艺术很多时候重视程序化和框架，以个人情绪太过外露为陋习。这是时代的
不同，不好古今划一。许多音乐家不喜欢贝多芬过于personal的音乐，觉得巴赫、海顿
更加伟大；古典的词评皆尊吴文英之流，而以李后主为“非正声”。我觉得并不是这些
评论家不懂得value艺术中流露的真情，只是三观不同罢了。就我个人来说，李后主词
确是天籁，这... 阅读全帖 |
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s*l
发帖数: 9421 | 10 动物也是想表达的，只不过它们不会花言巧语、大都以实际行动来完成表达，而人因为
智慧高心理复杂，往往会考虑如何表达的方式和艺术性。关于你说的性这个东西，女人
喜欢一个男人的时候，她会想为他生个孩子，这比仅仅的性爱更深了一层。男人呢则不
同，性爱是他的目的，到此为止了，爱女人的时候一定要通过性爱才能彻底表达。 |
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a*o
发帖数: 25262 | 11 动物的表达方式只是要满足它切逼的需要，就如母的发情的时候，碰到个公的，就交配
了，然后就分道也许永远也再也见不着了。这是动物的天性，当然有些动物也是成双成
对让另外一种动物“人”去赞美。。
但是那些都只是动物的天性，活着的意义。
相反，人所谓有“智慧”就是美其名曰附加的装饰词。有了“智慧”其实就把直接的表
达用掩盖的方法表达出来，也可以说是伪装。。
其实哲学，心理学研究不就是反“伪装”把人重新归纳成为动物行为的东西?让人把要
表达出来的譬如“性”直接表达出来，不用扭扭捏捏地脸红装着不需要？ |
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S**b
发帖数: 1883 | 12 如，中文里“感情”这个词。比如，我们两已经沒有什么感情了。
英语怎么翻？
We have no feeling for each other anymore
We have no love for each other anymore
第一，feeling这个词才粗糙，更本表达不出中文里“感情”这个词的意境。
第二, love是爱情，和感情意思有明显区别。
再比如，什么什么伤害了中国人民的感情。
外交部翻译是 hurt the feelings of the Chinese people. 经常被外国人嘲笑，有一
部分原因是这个feeling, 太粗糙，和原句想表达的意思差了好几个级别。英语这句话
感觉是个幼儿园小孩赌气，说"you hurt my feeling!". 其实这里哪里仅仅是feeling
的意思。
---
太多太多中文词汇没有英语可以表达出相同的细腻感。但是，反之则不然。英语里面表
达内心世界，表达人生态度，描述风景，等等的词汇和说法，中文都能轻易找出比你更
深厚更细腻的词汇。
比如，我说“这篇文章一气呵成，让人读完感觉回肠荡气，拍案叫绝，心情久久不能平
静”。这句话中... 阅读全帖 |
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e*******0
发帖数: 1487 | 13 英文有百万词汇量，不可能无法进行细腻的表达。而中文则有五千的单字可供组词，其
表达能力也是毋庸置疑的。不过，任何一种语言都是用来表达思想的，没有思想，任何
语言都无法优美。我们这一代人并非中文远远不如过去，而是思想被约束得太久，即便
如此，如果你找到了合适的地方，仍然能够找那些优美的文字。你所列举的这部分公众
演讲在国内恰恰是文字表达最弱的部分，原因不是文字，而是思想上没有发挥的空间，
也没有能够发挥思想的人。举个例子，去听大学的法学院名嘴的课，常常会有意外的惊
喜，因为，研究法律的人本质上是在研究社会、思想和逻辑，他们有思想，语言能力往
往胜过中文系教授。 |
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s*****h
发帖数: 170 | 14 表达能力的几个作用：
1。让别人知道你在想什么
2。让别人知道你的见解
3。让别人同意你的见解
为了达到这些作用，有时候不光要有内容，还要有表达能力。比如obama的演讲，内容
挺简单的，但
是说出来感觉不一样，煽动性也不一样。
当然表达能力也要配合表达的目的来使用，甚至有时候是表演能力。 |
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k********k
发帖数: 5617 | 15 发信人: tonyblair (死猫), 信区: Piebridge
标 题: 闹不清楚女征男表达自己热爱健身爱跳舞是几个意思?
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Aug 28 14:42:34 2016, 美东)
你说你要爱做饭吧, 还说得过去.
你表达你爱跳舞爱挑ZUMBA爱瑜伽, 是几个意思?
你觉得男的会关心这个? 大多数都不会理你吧.
(除非你要表达的是羞羞的事情你很强的意思?)
还有征婚里表达会说几门语言的........
Do you even know what guys want?
你可以说男人们肤浅, 但目测只有这几条管用:
0. 年龄和育龄；
1, 容貌;
2, 身材;
3, 人品;
4, 性格;
除此以外, 你跟男的说我能上天入地, 有个屁用！ |
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S**b
发帖数: 1883 | 16 比如，中文里“感情”这个词。比如，我们两已经沒有什么感情了。
英语怎么翻？
We have no feeling for each other anymore
We have no love for each other anymore
第一，feeling这个词才粗糙，更本表达不出中文里“感情”这个词的意境。
第二, love是爱情，和感情意思有明显区别。
再比如，什么什么伤害了中国人民的感情。
外交部翻译是 hurt the feelings of the Chinese people. 经常被外国人嘲笑，有一
部分原因是这个feeling, 太粗糙，和原句想表达的意思差了好几个级别。英语这句话
感觉是个幼儿园小孩赌气，说"you hurt my feeling!". 其实这里哪里仅仅是feeling
的意思。
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太多太多中文词汇没有英语可以表达出相同的细腻感。但是，反之则不然。英语里面表
达内心世界，表达人生态度，描述风景，等等的词汇和说法，中文都能轻易找出比你更
深厚更细腻的词汇。
比如，我说“这篇文章一气呵成，让人读完感觉回肠荡气，拍案叫绝，心情久久不能平
静”。这句话... 阅读全帖 |
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S**b
发帖数: 1883 | 17 比如，中文里“感情”这个词。比如，我们两已经沒有什么感情了。
英语怎么翻？
We have no feeling for each other anymore
We have no love for each other anymore
第一，feeling这个词才粗糙，更本表达不出中文里“感情”这个词的意境。
第二, love是爱情，和感情意思有明显区别。
再比如，什么什么伤害了中国人民的感情。
外交部翻译是 hurt the feelings of the Chinese people. 经常被外国人嘲笑，有一
部分原因是这个feeling, 太粗糙，和原句想表达的意思差了好几个级别。英语这句话
感觉是个幼儿园小孩赌气，说"you hurt my feeling!". 其实这里哪里仅仅是feeling
的意思。
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太多太多中文词汇没有英语可以表达出相同的细腻感。但是，反之则不然。英语里面表
达内心世界，表达人生态度，描述风景，等等的词汇和说法，中文都能轻易找出比你更
深厚更细腻的词汇。
比如，我说“这篇文章一气呵成，让人读完感觉回肠荡气，拍案叫绝，心情久久不能平
静”。这句话... 阅读全帖 |
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d*****r
发帖数: 5934 | 18 彻底摧跨SARS病毒，靶点必须对准病毒蛋白。中国科学家已成功克隆SARS病毒的6个主要
蛋白基因，并成功完成SARS病毒中3个主要蛋白的表达。这是继SARS病毒分离成功和病毒
全基因组测序成功之后，科学家对SARS病毒研究取得的又一重要阶段性成果。
中国科学院上海生命科学研究院院长裴钢16日宣布：经过这个研究院多个研究所的联合
攻关，研究人员成功克隆了SARS病毒中的S、M、N、E及RNA聚合酶、(3CL)蛋白水解酶等
6种主要蛋白基因，并在病毒重要蛋白质基因的表达、分离、纯化实验中，获得了SARS病
毒中E蛋白、N蛋白和(3CL)蛋白水解酶三种蛋白的表达样品，表达样品已进行药物虚拟筛
选。
科学家从实验中发现， SARS病毒颗粒周围环绕着像日冕一样的圆环，圆环之上和外壳表
面分布着大大小小的蛋白。但是对感染患病起重要作用的可能是6种关键蛋白：E蛋白、
S蛋白、M蛋白、N蛋白、多聚酶和（3CL）蛋白水解酶。
据研究人员介绍：E蛋白是小的包膜相关蛋白，在冠状病毒的自我组装过程中起至关重要
的作用；N蛋白是冠状病毒中一种重要的结构蛋白、含有其它冠状病毒N蛋白中不存在核
转移的信号序列，研究 |
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K****N
发帖数: 10783 | 19 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: walks (declaw是砍手指，不是剪指甲), 信区: Joke
标 题: 转载-老美突然问了我句：你们中文里关于做爱，有多少种表达方法？
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 26 00:03:41 2010, 美东)
那天老美突然问了我句：你们中文里关于做爱，有多少种表达方法？
来一则，发生在我和另外一名美国留学生之间。当时他们都已经被诸如“戊、戌、
戍、戎、戒”或者“己、已、巳”这样的汉字给折腾得快疯了，我很得意，经常有
意无意就在他们面前夸耀中文的博大精深。结果有一天，这老美终于忍不住了
那天我又跟他们说起中文里关于“妻子”有多少种说法，“吃饭”又有多少种说法，
如此等等。说着说着，这老美突然问了我一句：“K，你们中文里关于做爱，
有多少种表达方法？”
我听他这么问，也没想许多，就拿出张纸来开始给他写，穷举了从文雅的
云雨交媾到粗俗的XX（注，此为屏蔽）等大概三十来种中文里关于做爱的
表达方式，完了把纸递给他，心想：你小子这下得服气了吧？
孰料那老美接过纸后扫了一眼，淡淡说道：“K，我们英语里关于做爱的表
达方 |
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A***g
发帖数: 191 | 20 所在的实验室是一个烧钱的实验室，做几十个转录因子，实验套路大致就是qPCR和
western结合检测不同基因在不同human cell line中的表达，然后挑出表达合适的细胞
系去做siRNA和Chip-seq，目的呢，找出这些转录因子的binding site以及pathway什么
的。
我其实只是一国内小硕在这里做一小技术员，可是目前实验室没有post-doc，所以这些
实验基本上就着落在我和另一技术员身上，她负责做siRNA，其它的实验都我做。
照着protocol做实验当然没问题啊，遇到不懂的没人问就难办了。可是我成天闷头赶实
验，哪里有空看文献呢，所以就只好跟science脱节了。
做qPCR还好说（其实也有困难，另行发帖请教），我用的是GAPDH作为internal
control来计算相对表达量。可是做western时，我一开始选的是GAPDH做内对照，买的
是Sigma的抗体，做的还挺好的，因为这个GAPDH检测大小是36kd，正好跟我的目的蛋白
50-75kd能分开，我转一张膜，然后剪开就可以同时检测两个抗体。可是老板在我上周
汇报结果时说GAPDH主要在细胞质表达 |
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M*****e
发帖数: 279 | 21 多了一条常染色体的遗传疾病，如Down syndrome (21 trisomy)。常有多种身体和智力
发育异常。应当与这多出染色体上的基因表达有关。正常的两条，再加上这多出的一条
，应当导致位于这些染色体上的基因过量表达，然后引起疾病。这些过量表达的蛋白可
能有酶(such as, kinase, phophatase, protease, etc.)和transcription factors，
最终通过复杂机理导致疾病和相应的表现。
有些疾病(如有些肿瘤）是由于染色体易位(translocation)导致正常的基因易位到被强
的promotter控制，导致基因的过量表达。比如CML (BCR-ABL)。有的易位到
immunoglobin的promoter控制。Ig promoter是强的promoter.
应当可以从PubMed查对详细的疾病和致病蛋白的信息的。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 22 就像楼上所说，可能是GST增加了你的蛋白的溶解度，而在pEXP5表达载体上表达的可能
是misfolded，然后被host降解了，所以没有看到inclusion body。
还是那句话，如果你需要的蛋白量不大(100-500 ug)，用leaky expression也许就够用
了，或者用GST载体表达，然后用protease切掉GST Tag。如果你需要的量比较大（>1
mg），你可能就需要做一些蛋白表达条件的优化，比如temperature, host, inducer
concentration, chaperones, tags etc.。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 23 试图从血清中提取mRNA（从损伤和死亡的内皮细胞中释放入血）做RT-PCR。由于含量极
微小，担心血细胞mRNA带来的干扰。所以想找个基因，在内皮不表达，但在血细胞中稳
定表达，来看看这个干扰到底有多大。
或者，如果能挑选一个内皮稳定、特异表达的基因，来做内参，也行。
各位科学家，有什么建议吗？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 24 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
我设计了一个质粒，想表达一个fusion转录因子。但是从sds－page上来看，没有
overexpression的迹象，但是做wb，用该转录因子的抗体可以看到条带，虽然不多。用
gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段，也就是说，表达的蛋白被
chop了，即使bl21是protease deficient的。。。
现在都不知道怎么办，应该用病毒表达这种full-length的？ |
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g*****y
发帖数: 6325 | 25 我的蛋白bl21(DE3)的细胞里0.5mM IPTG induction 表达很好。后来转到BL21(DE3
pLysS)里 加IPTG却不表达我试过
0.1-2mM的IPTG. 2hr, 4hr 和 o/n. 2mM IPTG O/N 好像有一点点表达。。 都是同样
的蛋白同样的hosting vector. 现
在怀疑是不是BL21(DE3 pLysS)里表达的lysozyme 把我的蛋白降解了? 不太可能啊！
大家有没有遇到类似的情况呢？ |
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H****s
发帖数: 301 | 26 对于puromycin抗性的克隆筛选来说，这种情况是非常普遍的。看看你的载体吧，如果
标靶基因和puromycin抗性是由不同的启动子驱动的，那么你运气不太好，需要多筛选
克隆。主要有两种解释：（1）lentiviral/retroviral载体介导的异源表达，很普遍的
一个现象是整合到基因组的序列被flanking genomic sequences灭活。具体怎么回事，
现在还不太好解释。（2）低表达或者是不表达的细胞outgrow表达标靶蛋白的细胞，所
以，几代以后，你基本上丧失标靶蛋白的表达。
有两个建议：
（1）。使用抗性基因和标靶基因被同一启动子驱动的载体。标靶基因和抗性基因中间
有IRES。这样，产生抗性的细胞系必然表达标靶蛋白。如果被flanking genomic
sequences灭活的话，细胞会死亡，因为抗性丢失。
（2）。如果筛选到合适的细胞系，在前面几代要多冻存细胞。这样在后面的实验中你
不会丢失辛辛苦苦得来的细胞系。 |
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S******e
发帖数: 393 | 27 当时我转的蛋白较大，检测tag可以看到表达，但用蛋白本身抗体检测就看不大出来差
异，说明表达量还不够高。
MCS后一般有stop condon, 所以你的stop condon 没测出来应该没大问题。
我做transfection的质粒一般A260/280 是大于等于1.9， Qiagen kit prep.
plasmid浓度最好1ug/ul 以上。
我觉得你看不到差异的原因很可能是表达量还不够，但你没有tag也没法检测它是否已
表达，你把效率提上去再检测看看，我觉得还是很有希望。
提高转化效率也是我一直的问题，但我估计我转的质粒比你大，我前几天在这问过这个
问题。 你先用脂质体方法试两次，LTX或lip2000, 若还不行，建议你再try电转，据说
效率高出很多。 |
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w***7
发帖数: 1637 | 28 人家已经跟企业签约，并不仅仅是忽悠国家的钱，企业的钱没有那么好忽悠。说了，美
国这边有不少植物中成功表达药用蛋白的例子。
每一个表达系统都会有蛋白活性问题，细菌，酵母，细胞，和现在的植物，能得到有功
能的活性蛋白就行。你去问问你周围做结晶的，用的表达系统也是五花八们，并且很多
表达的是那种最难的膜蛋白。 |
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s******3
发帖数: 28 | 29 蛋白本身不长，才50个不到aa，但是有8个cysteine!之前做表达用大肠融合表达，切了
之后就沉淀啦，估计是二硫键氧化后聚集啦，后来先在空气中把溶菌液搅拌加过氧化氢
氧化，再切，发现切不掉啦，没办法，老板让做真菌和植物，觉得不怎么靠谱呀，因为
蛋白本身就是抗真菌的。哪位前辈给点提示吧，这个做包涵体然后复性有戏吗？或者其
他什么比较高效点的表达系统？有人做过类似的东西么？谢谢呀 |
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a*******u
发帖数: 19 | 30 A-CFP和B-YFP（或B-CFP&A-YFP）共转HEK293T，COS7，使用lipofectamine 2000转染（
按说明书操作）48小时后，细胞中只有A-CFP或B-YFP，但是没有2个蛋白一起表达的细
胞。A在80 kD左右，B在90kD左右，是不是A和B蛋白太大，两个不容易一起表达？如果
将用A的剪切体约45kD再和B全长去做FRET估计能共表达吗？
Hela里共转Flag-A和His-myc-B的时候A表达很低，所以就没试；293T和COS7中Flag-A和
His-myc-B共转都没问题。 |
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A*******e
发帖数: 284 | 31 请教，我用GFP融合一个转录因子表达，用western测表达量。现在发现表达量不高，
所以western结果不漂亮，free GFP的control倒是浓的一塌糊涂，请问有什么可以改进
的？
我用santa cruz的GFP-HRP抗体，现在看来似乎不好，出现了若干杂带，原本表达量就
不高，还搞些杂带就更麻烦了。 可有好的偶联HRP或AP的GFP抗体推荐， 多谢了 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 我们也有类似经历，不过幸运的是我们转进去的只是一个单独的GFP
reporter, 看不到就拉倒了，反正有其他方法来知道哪个是transgenic老鼠.
我们的感觉是很多转进了老鼠内部的基因会有可能被体内的机构关起来不让
表达，或者表达大大降低。
你的情况，最好是这样：
１。把组织提出来做western blot
2. 用anti-GFP 来加强荧光。
我们一向都用Roche mouse anti-GFP，他家的抗体stock solution稀释得比较高，所以
用的时候不能稀释太多(所以比较不经用），但是特异性比较高。
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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X*******0
发帖数: 134 | 33 某原核蛋白,在其原来的菌里的定位未知,蛋白序列本身找不到信号肽.
在大肠杆菌里表达.由于胞质表达总是包涵体,于是改周质表达.用的是pET26b,就是N端
加了一段pelB信号肽的.问题来了,表达完的蛋白去哪儿找?用哪部分纯化?是用细胞,还
是用培养基上清?问题等价于,蛋白(46kD)会不会大多数穿过细胞壁漏到培养液中.
做生化的,大量提蛋白解结构的,比较容易解答我的问题. |
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q****2
发帖数: 208 | 34 最近看了一些文章， 感觉大部分似乎认为10A不表达ER，可是也少在文章里面说检测到
了表达？ 是不是因为不停的传代，久了之后某些就开始表达了？ 有没有朋友有做过这
个的？ |
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w******n
发帖数: 767 | 35 鼠的基因在人细胞表达完全没问题。但是看启动子，不知道你这个基因应该在哪个组织
表达，BAC因为是基因本身的启动子，所以如果不是看家基因，可能需要特定的细胞系
。比如特定在肝脏表达的鼠基因要到对应人的肝脏细胞去表达。
?
is |
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C*****h
发帖数: 926 | 36 用lentivirus去overexpress蛋白，是很难的。
单个细胞最多接受几个virus，基本上不会有多少蛋白表达（很难检测到）。
在mammalian cells里，蛋白表达本来就不是高效的。
用质粒直接转染，每个细胞接受几万个copies，蛋白质表达都不是很高，
区区一两个virus能在细胞里表达多少蛋白质？ |
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f*****n
发帖数: 12752 | 37 recombinant cho表达一个酶，如果改变表达条件（如ph，温度，养分组分等）使得
mRNA表达量翻倍，有没有可能导致蛋白表达量翻七八倍？需不需要其他机制，如增加蛋
白稳定性，的存在？
十分感谢！ |
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s******s
发帖数: 13035 | 38 教你一招，这个不需要啥特殊载体，直接加2A就可以了
2A包括T2A，P2A等等，大多数是十几二十个aa的sequence, 能够
mediate co-translational cleavage，翻成白话就是一个蛋白里面
有这个sequence, 一边翻译一边就被切两半了。你要做的就是表达一
个大蛋白，中间插上2A，表达出来自己就变成四五个小蛋白了，好处
是表达量相同；类似的可以加ires，不过后面蛋白表达量小。
这么多基因怎么clone成一个大蛋白呢并且加2A呢？很简单，google
neb gibson assembly mix就知道了。PCR的时候头上加部分2A sequence，
四五个片段放在一起，加mix "biu。。。"的一声就变成一个片段了，呵呵 |
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i*********0
发帖数: 915 | 39 这个骨架蛋白，文献上都说的是神经元细胞特异的表达，会不会在其他地方也表达？
最近做的ES 细胞的IF， 发现OCT4+ 的细胞也表达β-Tubulin III +。但是一旦ES细胞
分化了，这个表达就没有了。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 40 那你用ＢＬ２１ ＤＥ３干啥。
你在３７度下Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里看见，低温下看不见，也不是什么超级
诡异的问题。特别如果你是依靠铐染来鉴定蛋白的话。３７度表达快，蛋白都在ｉｎｃ
ｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里面，低温下，一方面细菌少，表达慢，且可能部分成为可溶
蛋白，同样体积下，Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ里的量会少很多。
所以，前面问你是怎么检测蛋白的。
不知道你用什么高级载体？不需要ＩＰＴＧ诱导，又为何用ＤＥ３菌株呢？ |
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b***q
发帖数: 18 | 41 职位要求：
1.硕士及以上学历，博士及有留学背景的优先考虑；
2.有扎实的蛋白相关专业背景；
3.英语六级以上，听、说、读、写精通；
4.较强的学习能力，与人沟通能力，具有团队合作精神；
5.做事细心，敢于承担责任，态度积极，能承受一定工作压力；
6.对熟悉cGMP, GLP，转基因动物等领域的优秀人才优先考虑；
应聘要求：
1.从事蛋白相关业务的开发，对市场有敏锐的观察能力，善于发现商机和好的业务，并
组织人员进行业务的拓展；
2.组织开展蛋白相关的高端技术服务，同国外客户能进行专业和深入的交流；
3.能努力奋斗，积极创业，对于好的创意公司将给予全方位的支持；
北京安必奇生物科技有限公司是由一批资深留学归国人员创办的生物制药服务公司。公
司依托深厚的国际资源背景、经验丰富的留美科研人员致力于生物制药服务并为客户提
供项目解决方案。公司现有服务内容主要包括应用杂交瘤技术生产单克隆抗体、利用噬
菌体展示技术筛选人源抗体，以及抗体亲和力成熟、人源化等抗体基因工程，蛋白表达
、纯化，多克隆抗体制备以及细胞工程等相关服务。此外，公司还可提供多种抗体的大
规模表达服务，如scFv、Fab、双价抗... 阅读全帖 |
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A*******e
发帖数: 284 | 42 简单一点说吧，处理和对照，每个40000万reads.如果处理组的rpkm为1.0， 对照组为0
或者远低于1.0。这个数据有效吗？ 该如何理解？ 我的一种理解是这个表达量都太低
了，直接认为该基因在该tissue里面没有表达，从而不在该tissue里发挥功能。但是问
题又来了，往往一些很重要的基因表达量还挺低的。
rpkm为多少可以认为有效表达？现在journal有无比较公认的数值？请推荐paper或讨论
。多谢！ |
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M*P
发帖数: 6456 | 43 测的再多也用处不大，除非你能用什么手段去enrich lincRNA. 因为lincRNA表达都很
低，你测的read里面大多数都是coding gene/ribosomal RNA，基本上都浪费掉了. 之
所以有人用array，就是因为这个问题。我们最近刚做过，上千个已知lincRNA里，只有
一二百个表达量超过 1 read per million.
你不如先试试 pcr，看看一些已知的lincRNA在你的 tissue里是否表达，然后跟一些已
知的house keeping mRNA比比表达量，你就知道想用RNAseq直接全把lincRNA测出来是
不可能的 。
LncRNA
Multiplexing
reads/ |
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x******3
发帖数: 111 | 44 现在正在做WB 检测GFP-Tagged的目的蛋白的表达，尝试了6种GFP 抗体，发现在人的细
胞中都能够检测到GFP 表达，但是在鼠的细胞中只有ABCAM的AB13970检测到GFP 表达（
但有其他一堆杂带），其他的抗体都能看到一堆bands，唯独没有GFP 的bands，主要是
砸带太多，曝光不能爆太久。
有大神能帮忙介绍一下在小鼠细胞中WB检测GFP 表达的经验吗?
不能用目的蛋白的抗体因为做的目的蛋白的truncated protein。
那个abcam的ab13970是鸡抗体，不知道怎么样去优化？（4%BSA block， 400mA/2hrs
transfer）
非常感谢！ |
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a**********3
发帖数: 86 | 46 如题，现在做一实验。想要探讨A蛋白对于某cell line的作用。低浓度的A作用于细胞
48h后，进行real time RT-PCR检测发现A蛋白显著促进osteocalcin (OCN)(+60%)的基
因表达，而显著抑制osteopontin (OPN)(-27%), dentin matrix protein-1 (DMP-1)(-
64%)及bone sialoprotein（BSP）(-22%)的表达。想进一步深究A对于osteocalcin的基
因表达增强的机制，是否可以从gene promoter方面研究？另一方面，关于A对于其余三
个蛋白特别是DMP-1的抑制作用，又可从哪些方面进行深入探讨？本人为科研新手，希
望大家不吝赐教。 |
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m***o
发帖数: 272 | 47 可能没表达清楚，现在是想确定这个病毒确实可以表达IGF1，因为已经注射给老鼠，没
看到明显的体重变化，所以做细胞确认一下。因为买的病毒，直接就给老鼠了。
血清也做wb，什么看不到，也做了老鼠的liver tissue，也是什么都没看到（不论17kd
还是8kd），所以比较疑惑。细胞怎么48小时有表达（只有17kd），72小时反而没了？
比较确定实验中没有犯低级错误，比如加的不准什么的。 |
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r***l
发帖数: 593 | 48 我们用预先导入A基因的Phoenix-ECO cell去转染T cell，但是flow看不到A基因的表达
。人家说你可以先run flow看看Phoenix-ECO cell里面这个基因是否表达？
很好奇Phoenix-ECO cell会直接表达这个基因吗？用PCR check是不是有A基因的DNA才
对吧？
不是很懂，请大侠帮忙看看，谢谢！ |
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C*******4
发帖数: 400 | 49 应该会表达，试试包装一个GFP的病毒重复一下你的实验你就能看到这个细胞里面有表
达（因为一般是做转染瞬间表达）。再用它感染你的T细胞。就可以直接检测荧光赖看
表达了，在知道大概的感染效率之后再做FLOW才有意义因为有时候病毒滴度太低你的检
测很难。。 |
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