b******s
发帖数: 228 | 1 想在哺乳动物细胞中表达几个microRNAs， 是不是用一般的表达载体就行了, 比如
pcDNA3或某些
lentivirus载体？有什么需要特别注意的吗？
谢谢！ |
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i******0
发帖数: 17 | 2 用retrovirus deliver transgene into NIH3T3 cells. 以前都用一次infection, 然
后就做selection. 蛋白表达不太高. 请问如果我infect 两次, 或者是三次, 会增加蛋
白的表达量吗? 若要这麽做, 每次infection 之间需要做selection 吗?
请高手指教, 谢了. |
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K*C
发帖数: 2825 | 3 多谢。我们组以前从一细菌clone的一个heterodimer protein,然后俩protein gene之
间那段序列是TTAATATTTTCTAAAAGGAAAGAGAC，其中AAGGAA是rbs，但是不是E.coli里面
最常见的，前面那段序列我觉得是有TAXXAT，应当是个promoter。你觉得呢？
然后这clone到pET里面也能很好表达。就是不知道前面一个protein是否比后面一个多
，因为两个一表达出来就bind到一起了。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 4 以前有些paper做这个的，多个基因的表达，现在我也懒得找了。
另外比较简单的方法，分别把a,b基因克隆在pET21b上，再做一次PCR得到连同启动子，
a基因和terminator，再酶切连接到b基因的表达质粒上。最终a,b都有自己的T7
promoter,都受IPTG诱导。当然诱导程度不一定相同。
这样你就不纠结了。 |
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c***y
发帖数: 615 | 5 想检测一段DNA序列 (3'端)是否有降低基因转录的功能。大家一般是怎么个思路？
初步想克隆这段DNA到 luciferase 载体的3'端,看是否影响luciferase的表达.问题是,
选择什么样的promoter呢.担心太强的,看不出效果;太弱的话,可能根本不表达
还有, GFP作reporter 会更好吗? 与luciferase相比,哪一个更敏感些?
多谢... |
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h**********d
发帖数: 30 | 6 基本情况：
E.coli C43, cyoABCDE knockout(Km)表达cytochrome bo3, tyrA knockout(Cm)
tyrosine生物
合成中的一个酶（从prehenate到4-hydroxy-phenylpyruvate)
pAc-YNH2 plasmid(Tet): proK promoter + 6 copy of M.j tyrosine tRNA, glnS
promoter
+ 3-aminno-tyrosine M.j tRNA synthase (M.j is an archea strain)
pET plasmid(Amp): T7 cyoABCDE w/ cyoB Y288Amber stop codon mutation
要表达的是cytochrome bo3 mutant protein, 在蛋白里genetically引入一个非天然氨
基酸
（peter schultz组的技术，pAc-YNH2质粒也是从他们组拿给MIT的STUBBE组做的，她们
组没遇
到过这个质粒的问题）
这两个质粒同时存在于E.coli c43里的时 |
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r***e
发帖数: 2539 | 7 lentivector 转录整个病毒RNA的promoter在5UTR 前面，内部还有自己的Promoter。
有时候内部的Promoter和你的基因配合不好，但是还可以从外部promoter表达。
一个例子就是Tet on vector，要感染才能用dox调控，转染的话，不用dox都表达，就是
从外部promoter。
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a******e
发帖数: 570 | 8 我做一个革兰氏阳性菌的microarray，用不同的天然产物（主要是高分子多酚类）处理
细菌，发现基因表达和对照组没有啥区别，连一个基因都没有选出来（P=0.05)，这个
看起来正常么？我怀疑高分子多酚不能渗透到细胞里所以不能影响其表达。希望经验多
的牛人给点意见。 |
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J********n
发帖数: 534 | 9 如果你表达的是kinase，很容易自己修饰自己。
如果你表达的非kinase, 有少许可能被修饰，可能在Serine, Threonine, Tyrosine,
Histidine, Aspartate被修饰。
一旦被修饰而你又很介意的话，可以co express一些phosphatase, 或者invitro
dephosphorylation. |
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s******e
发帖数: 1073 | 10 I got the following from the web, does these mean no specific
phosphorylation or no phosphorylation at all?
"在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵
体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。" |
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e*******c
发帖数: 1479 | 11 最近课题卡在一个病毒表达体系上，我想利用一个病毒体系在我的肿瘤细胞中高表达一
个蛋白，我选择的是Clontech的pLHCX系统，但是利用几个细胞的方法去包装感染细胞
都不出任何稳定细胞系，比如PT67, phoenix 细胞等，请教各位如果有经验的提供点信
息。谢谢 |
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f******s
发帖数: 288 | 12 想找一个database，能够查某一个蛋白的表达对其他蛋白表达水平的影响的。比如在某
个cell line， 一个蛋白over express，会up regulate／down regulate 其他什么蛋
白。
感觉应该有不少microarray 的database，但是有没有针对蛋白水平的database呀？ 还
是都要靠查paper的说？ 谢啦！ |
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f*******e
发帖数: 354 | 13 KO 有很多种：Conventioanl KO，可能会出现truncate
conditional 一旦cre表达不全或不过 确实可能KO不全
inducible的那就更有可能了
移植的肿瘤后有表达？
是移植了KO的肿瘤还是一直到KO的小鼠，这样两种细胞有一种不是KO就嘛事就有可能了
啊？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 14 一般来说加了IPTG对蛋白的表达会有明显影响的，如果可溶部分不变的话，很可能都跑
到inclusion body去了。
不过优化蛋白表达是很费劳力的活，如果你的实验对蛋白量要求不大的话，leaky
expression也能凑活着用。 |
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a****l
发帖数: 125 | 15 请教，自己没用过，但想必在座有人知道。这inducible expression system, 象
tetracycline 什麽的，真能控制transgene 的表达的量吗？小弟需要titrate 一个外
源基因在细胞里的表达量。什麽inducible 的系统好使？
谢了 |
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r********r
发帖数: 104 | 16 有人做过细胞核外膜膜蛋白的表达吗？ 如果是在真核细胞里面表达，是不是要先在ER
中，再转运到细胞核上去插膜？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 17 嘿，是你。
转录因子，连上fusion的部分，就2.4kb。
我就连在了pGEX-2T系列上，因为要做表达用，当然还用过TA vector。。。
培养基一开始用LB，后来照manual里用了YTA，其实和LB差不多。。。
我大概知道是什么原因了，我想换真核表达系统试试。。。
谢谢。 |
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w*********e
发帖数: 98 | 18 想在大肠杆菌中表达一个N末端GST融合的真核蛋白。但是表达出的都是C端缺失的蛋白
。因为 用GST antibody 可以检测到非全长的蛋白条带.请问如何改善条件才能获得全
长蛋白？多谢！ |
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s*****i
发帖数: 315 | 19 没有kozark表达量高低是不可预测的，运气好也可能高表达
还是加上吧 |
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s********n
发帖数: 2939 | 20 既然在BL21(DE3)表达很好的话，为什么还要试BL21(DE3)pLysS呢？有特殊原因？我的
经验是BL21(DE3)pLysS表达很多蛋白都不好。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 21 对，还有一个我忘了说，就是检查一下培养箱温度。
我原先用BL21-Gold的DE3 pLysS表达出现问题troubleshooting的时候，后来发现就是
培养箱温度不对，设定37度，实际到了39度。这时候用BL21的DE3 pLysS表达就没有问
题，但是BL21-Gold的菌液几乎完全被lyse掉了。所以后来虽然我把培养箱温度重新设
定好了，还是不敢再用BL21-Gold的菌株了。
induction. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 22 我原来在版上发过帖子问过的：
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31400349.html
你看看和你的culture长得像不像。
实验室表达蛋白用的大肠杆菌菌株都不是野生型的，通过基因改造改良了很多性状。其
中不少是通过噬菌体转染的手段整合到大肠杆菌基因组的。比方说名字含有DE3的菌株
，就是溶源性整合了λ-DE3噬菌体，用于表达T7 RNA polymerase。溶源性噬菌体一般
不会裂解，而是随宿主细胞一起复制。但是极少数情况下会产生自发裂解或者诱发裂解
。我上次碰到的情况是和培养箱温度有关，有可能是培养箱温度过高诱发了噬菌体裂解
，但是其他的一些极端条件也可能会是裂解的诱因。
大部分情况下溶源性噬菌体被诱发裂解是因为宿主细胞遇到了不利的生存条件，我觉得
在你的情况下，会不会有可能是因为minimal培养基营养不够？你试试改改培养基的配
方看？不过我上次在买了新的感受态细胞重新转化之后，对温度也不敏感了，所以也许
换一个新的strain也有用。 |
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W****C
发帖数: 1937 | 23 很久没做原核了， 谁推荐个质粒吧， ｅｃｏｌｉ里表达一个２００个ＡＡ的病毒蛋
白， 之后要纯化蛋白。 需要表达效率高， 容易筛选， 可调控。 |
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l*****e
发帖数: 138 | 24 已经试过了hydrodynamic injection 和用liposome介导的表达系统，但是感觉效率都
很低。主
要想让基因过表达在小鼠肝脏部位。有什么更好的方法么？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 25 Hydrodynamic Tail Vein的效率应该是非常好的，如果在你这里效率很低，那么很可能
要么是手法问题，要么是构建问题，可以先用luciferase reporter construct做对照
检查一下手法。
一过性表达HTV足够了，想持久表达那就得上病毒载体了，lenti或者AAV都是非常好的
选择 |
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b********c
发帖数: 161 | 26 表达的是外源蛋白不是内在酶。多谢楼上几位的回复， 我其实就想在可溶上清里面找
到蛋白而已，因为我太怀疑全部表达蛋白都跑到inclusion body 里面去了。而且类似
的4，5个蛋白基本都在可溶上清里面提纯的出来。 |
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N*******k
发帖数: 270 | 27 我曾经表达过两个氨基酸相似率高达92%的细胞因子A和B， A是怎么搞也没有可溶性的
蛋白；而B，可溶性表达是惊人的高， 一升的培养体系，可以搞出4mg.
可悲的是,我是从A开始的,浪费了一年半的时间,尝试了各种条件,温度,IPTG浓度,时间,
改成细菌偏好的密码子等等;而在我之前,一名博后也花费了大量时间在这上面,最后她
是遗憾的走人.
我的体会是,尽量用低温和低的IPTG浓度,减缓包涵体生成的速度. |
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b******n
发帖数: 4225 | 28 我们实验室现在也有人表达两个蛋白，算是同一种蛋白
不过是来源于同一属不同种的细菌
氨基酸identity也是高达50%以上，一样的载体和宿主菌
一个表达量奇高，而且可溶性相当好，大概能得到>40mg/L
另外一个低的多，可能低于5mg/L
间, |
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c********0
发帖数: 29 | 29 pET 的vector 可以用 autoinducing medium 表达，表达的蛋白应该是可溶的。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 30 现实和理想是有差距的，不是没有恋曲都有美好结局。
你的蛋白可能压根就表达后不稳定或不表达。
真。 |
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T*****n
发帖数: 274 | 31 谢谢，大受教宜。我的目标基因正是非常specific的表达在一个特定lineage
的特定发育阶段，其表达在RNA水平上受到调控，这也正是我猜测可能有microRNA
参与其中的原因。接下来准备去找找这个组织的miRNA profiling数据，还有
用你给的网站predict几个miRNA试试看。
关.
candidate |
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T*****n
发帖数: 274 | 32 其实也要视实际情况。比如knock out target gene的一个exon by introducing
frameshift and stop codon (对于很多很大的基因来说，这样做很常见），如果
RT－PCR的一条引物在敲掉区域，肯定是检测不到mRNA的；但实际上target
gene有可能表达为truncated/mutated form，这样子的话RT-PCR就会出错。
这种情况下，RT-PCR引物扩增没有delete的片段更加可靠,它可以明确告诉你target
gene是否有表达为任何形式。
当然，最可靠的手段还是southern和western。 |
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w***y
发帖数: 493 | 34 我把3xHA的tag接到蛋白的N端, 然后做了in vitro transcription得到了mRNA. 接着把
mRNA注射到了鱼的卵里,另外准备了一些uninjected fish作为negative control, 一段
时间后做western观察蛋白表达情况. 我发现在那些negative control的样品里也有带,
而且量还不少, 大概在75KD 左右. 我试过两个不同的 anti-HA的抗体, 结果都一样.
请问有人在zebrafish里面表达过HA-tag的蛋白么, 有没有看到这种情况呢? |
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j****x
发帖数: 1704 | 35 如果从产出富含白蛋白的大米作为辅食营养品的角度来说，也不是不可以
但提什么每亩产量提纯蛋白按照市场价折算，就是纯扯淡，食品和医用级蛋白制剂根本
不是一个概念，真要基因工程表达替代人血浆来源的白蛋白，那也会选择哺乳动物细胞
表达系统 |
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w***7
发帖数: 1637 | 36 你完全不懂你在说什么。人家说的是在水稻中表达纯化后再药用的，不是食品级的。
美国现在有不少生物制药公司用农作物表达人源药用蛋白，你搜搜或者打听一下就知道
了。
杨的技术本来就是从美国san diego带回去的。 |
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w***7
发帖数: 1637 | 37 哺乳动物细胞表达蛋白最大的问题是成本，光一个 FBS 就贵得不得了。
我当年在上海卖试剂的时候，最喜欢的就是这种大批量买fbs 的工业界客户，卖一次一个月基本就不用干活了。给的价格也都是单独的。
FBS 还有一个问题是不稳定，不同批次FBS 表达蛋白的得率不一样，这个对工业界来说是一个很大的问题。 |
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d****h
发帖数: 4291 | 38 你也是老id了
估计是不做这一领域
前面有人说了，植物表达系统，弊端太多了
糖基化，磷酸化，酰胺化.......构象，折叠，任何一点都会影响蛋白活性
他表达出来的真的有没有用，他自己估计都不信
我老是趟过这个烂泥潭的人，这除了忽悠国家863的钱，坑死一代又一代的学生 |
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m**********2
发帖数: 6568 | 39 hehe, you never know. each protein is different. maybe he got lucky.
确实运气占很大成分。人类的知识现在不足以准确预测糖基化，磷酸化，酰胺化......
.构象，折叠 etc etc。在植物里表达，也许就有活性，也许就没有。有，你就发了。
没有，你就搭了。要是成功率高，谁还用动物细胞表达啊。但是，看看搞这一行的历史
，和现在的规模，就知道成功率是非常非常低的。但是哪，六和彩也总是有人中的。
you never know.
当然，话又说回来了。他这个估计是呼悠为主。可能性》99%。 |
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m**a
发帖数: 1228 | 40 先试试这个
我们以前一个类似的蛋白就是用pET22b在
periplasmic表达的
纯化的时候freeze/thaw，不用破菌
bonds |
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S******e
发帖数: 393 | 41 我的蛋白一个260kD，一个130kD
现在做共转染，搞的我头大
一个表达较高，一个表达很弱 |
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T**X
发帖数: 314 | 42 我有n个样本某个miRNA的表达值，以及一大堆其他基因的表达值，要找出之间的相关性
。我想到的是简简单单用prism或者excel找出r,r2然后列个表，我们老板非要我用LOD
值做一个类似曼哈顿plot的一个图，并且为我看了别人的图旦是没告诉我怎末做（明天
我给传上来样本），这种图我以前只在qtl分析的时候看到过，x轴是染色体，他要的图
x轴是"一大堆其他基因"，y轴就是LOD,还有p005p001横线。请知道的同学不吝赐教，谢
谢了，我们老板脾气不好不敢多问，又逼着我赶快下周分析出这个图。叩首！ |
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e****p
发帖数: 354 | 43 还有其他可能吗？ 蛋白表达后迅速降解了有没有例子啊 |
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L***s
发帖数: 133 | 44 整合位置应该是一样的，只是我的TARGET载体外加了个promoter，本想提高表达，难道
是promoter被silence了？
你说的“现在存在的ROSA-YFP要比ROSA-GFP表达强很多倍，解释的原因很多，很多人同
意就是整合的位点不一样”很有意义，有相关文献出处吗？
谢楼上几位啦 |
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n********k
发帖数: 2818 | 45 also fusion-GFP sucks most of time...
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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l*********i
发帖数: 332 | 46 how in vitro experiments are done exactly? details.
what kind of cell, what exactly construct have you used?
invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和
ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
lox |
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y*********u
发帖数: 183 | 47 很多commercial CMV driven 的plasmid能做到用IRES drive上游下游基因同时表达，
但很多文章里似乎说到如果把IRES knock in到内源基因的EXON，上游基因表达就会被
抑制(但也有说会增强的……) ， 雾水了 |
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q******g
发帖数: 3858 | 48 估计楼主的意思是，中药的作用机理有可能是通过植物miRNA来调控动物蛋白的表达。
而转基因植物也可能通过这个机理来危害人类或牲畜。当然，说悲剧还是早了些。不过
，我估计会有更多的文章关于植物miRNA调控动物基因表达/ |
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q******g
发帖数: 3858 | 49 估计楼主的意思是，中药的作用机理有可能是通过植物miRNA来调控动物蛋白的表达。
而转基因植物也可能通过这个机理来危害人类或牲畜。当然，说悲剧还是早了些。不过
，我估计会有更多的文章关于植物miRNA调控动物基因表达/ |
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h**********r
发帖数: 671 | 50 母鸡小蛋白啊。没准儿你要表达的小蛋白有特殊的生理功能，就是难高表达。换不同的
宿主试试 |
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